刀额新对虾过敏原蛋白的提取纯化及检测技术研究

论文摘要

虾及其制品以其较高的营养价值和独特风味,越来越受到人们的青睐,但由于虾是极易致敏的食物之一,严重威胁着人类的健康,因此开展虾过敏原蛋白的相关研究具有十分重要的经济和社会效益。本研究选用刀额新对虾（Metapenaeus ensis）作为研究对象,应用硫酸铵分段盐析法从虾蛋白粗提液中初步提取刀额新对虾过敏原蛋白,再用Sephadex G-100凝胶柱层析对初提物进行纯化。结果显示:pH 6.54,饱和度为40%的硫酸铵分段盐析沉淀组分经Sephadex G-100凝胶柱层析得到单一洗脱峰,经SDS-PAGE电泳得到1个电泳条带,蛋白相对分子质量约为36.1 kDa。经斑点免疫法检测该组分显示具有强烈的过敏原活性,确定了从虾提取过敏原蛋白的工艺参数。用纯化的虾过敏原蛋白,对6-8周龄的雌性Balb/c小鼠短程免疫,间接ELISA法检测抗血清效价及其交叉反应性,结果显示,该短程免疫法仅用19天便可制得效价为1:6400的抗血清;该抗血清对南美白对虾、黑斑口虾姑和中国明对虾的过敏原无交叉反应性;该抗血清经硫酸铵沉淀、DEAE-Cellulose DE-52层析和Sephadex G-150层析分离纯化,最终获得刀额新对虾过敏原的多克隆抗体。用间接ELISA法的原理设计刀额新对虾过敏原的检测方法,确定了虾过敏原的检测区间为0.32μg/mL-16μg/mL。本研究分离纯化了刀额新对虾过敏原蛋白,制备了小鼠抗虾过敏原蛋白的多克隆抗体,并建立了虾过敏原的检测方法,为虾及其制品中致敏物质的检测技术提供了可行的方法。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 前言
• 1.1 食物过敏的概述
• 1.1.1 食物过敏的危害
• 1.1.2 食物过敏的影响因素
• 1.1.3 食物过敏的反应机理
• 1.1.4 食物过敏原
• 1.1.5 甲壳动物过敏原
• 1.2 食物过敏原的提取纯化技术
• 1.3 食物过敏原的检测手段
• 1.4 多克隆抗体制备技术
• 1.4.1 免疫抗原
• 1.4.2 免疫佐剂
• 1.4.3 免疫动物的选择
• 1.4.4 免疫途径
• 1.4.5 多克隆抗体的纯化
• 1.5 本论文的主要研究内容
• 1.6 本课题的研究意义
• 第二章 刀额新对虾过敏原蛋白的分离纯化
• 2.1 材料与仪器
• 2.1.1 材料
• 2.1.2 仪器
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 刀额新对虾盐溶蛋白质的提取
• 2.2.2 硫酸铵沉淀法分离过敏原蛋白
• 2.2.3 过敏原蛋白活性的检测
• 2.2.4 SDS-PAGE电泳
• 2.3 实验结果
• 2.3.1 不同饱和度硫酸铵溶液的pH值
• 2.3.2 不同硫酸铵分段盐析沉淀组分的过敏原活性
• 2.3.3 虾过敏原的鉴定
• 2.3.4 硫酸铵分段盐析沉淀组分的层析结果
• 2.4 分析与讨论
• 2.4.1 硫酸铵溶液的pH值对沉淀组分的影响
• 2.4.2 虾过敏原蛋白SDS-PAGE结果的分析
• 2.5 结论
• 第三章 刀额新对虾过敏原蛋白多克隆抗体的制备及质量评价
• 3.1 实验材料与仪器
• 3.1.1 材料
• 3.1.2 仪器
• 3.2 实验试剂
• 3.2.1 ELISA检测试剂
• 3.2.2 Al（OH）3 佐剂
• 3.2.3 免疫原
• 3.3 实验方法
• 3.3.1 动物实验关键技术
• 3.3.2 动物免疫程序
• 3.3.3 Balb/c小鼠抗血清效价检测
• 3.3.4 多克隆抗体的特异性检测
• 3.3.5 多克隆抗体的提取
• 3.4 实验结果
• 3.4.1 接种动物的观察
• 3.4.2 ELISA反应条件的筛选结果
• 3.4.3 Balb/c小鼠抗血清效价检测结果
• 3.4.4 多克隆抗体的特异性检测
• 3.4.5 刀额新对虾过敏原多克隆抗体的提取
• 3.5 分析与讨论
• 3.6 结论
• 第四章 ELISA法检测刀额新对虾过敏原蛋白的实验设计
• 4.1 实验材料与仪器
• 4.1.1 实验材料
• 4.1.2 实验仪器
• 4.2 实验方法
• 4.2.1 包被条件、封闭时间和显色时间的选择
• 4.2.2 ELISA法的灵敏度检测
• 4.3 实验结果
• 4.3.1 反应条件的确定
• 4.3.2 灵敏度检测
• 4.4 讨论
• 4.5 结论
• 第五章 结论与展望
• 5.1 结论
• 5.2 展望
• 参考文献
• 发表论文、参加科研情况说明
• 致谢