论文摘要
哺乳动物卵母细胞的成熟是一个由外界信号诱导产生的细胞周期转换的过程。蛋白激酶C（PKC）信号通路被认为在促性腺激素诱导的哺乳动物卵母细胞减数分裂恢复过群中起到重要的调节作用。有研究表明PKC通过调节EGF/EGFR信号通路从而参与到促性腺激素诱导的哺乳动物卵母细胞的成熟,但是这种调节并非通过基应水平来调控,可能是通过调控蛋白前体剪切的方式,而肿瘤坏死因子α转化酶（TACE）是EGF样生长因子主要的蛋白剪切酶。在本实验中,我们利用FSH诱导小鼠卵丘卵母细胞复合体（CEOs）体外成熟模型,具体探讨了在FSH诱导的小鼠卵母细胞成熟过程中,PKC信号通路是如何通过调控TACE从而诱导EGFR信号通路的激活,最终实现减数分裂的恢复。我们首先研究了不同亚型的PKC在促性腺激素诱导的小鼠卵母细胞成熟中的作用。通过分别添加PKC的三种类型（cPKC,nPKC,aPKC）的特异性抑制剂：PKC α/β1特异性抑制剂Go6976,PKCδ/θ的特异性抑制剂rottlerin（MTX）,PKCζ特异性阻断肽与小鼠CEOs共培养,发现Go6976和PKCζ特异性阻断肽对FSH诱导的成熟没有影响。而MTX能剂量依赖性地显著抑制FSH诱导的小鼠卵母细胞成熟,但添加EGF样生长因子Amphiregulin （AR）则可以部分逆转这种抑制作用。在FSH处理4h后,FSH能显著诱导Areg, Ereg, Btc mRNA的表达,但是添加MTX抑制PKC δ/θ的功能,发现对FSH诱导的EGF样生长因子Areg, Ereg, Btc mRNA的表达没有影响。以上结果表明PKC δ/θ信号通路的确可能通过非基因调控的方式调控了EGF样生长因子从而介导了FSH诱导的小鼠卵母细胞减数分裂恢复过程。进而研究了TACE是否参与了FSH诱导的小鼠卵母细胞减数分裂的恢复。结果显示在FSH诱导成熟过程中,FSH能显著诱导CEOs中TACE的基因和蛋白的表达。而TACE特异性抑制剂TAPI-2能剂量依赖性地抑制FSH诱导的卵母细胞成熟过程。这暗示TACE参与了FSH诱导的小鼠CEOs成熟。根据上述结果,我们最后研究了PKC δ/θ信号通路在FSH诱导卵母细胞成熟过程中调控TACE活力的机制。结果显示NADPH脱氢酶及其产物ROS的特异性抑制剂diphenyleneiodonium chloride （DPI）和1,3-dimethyl-2-thiourea （DMTU）分别可以剂量依赖性地显著抑制FSH诱导的小鼠CEOs的成熟,然而AR可以部分逆转这种抑制作用。免疫荧光结果显示FSH培养1h时,与对照组相比,卵丘细胞中的NADPH脱氢酶（NOX）的胞质组分p47phox以及p67phox开始转移到细胞膜上,与细胞膜上的组分形成有活性的NADPH脱氢酶,然而这种转位现象可以被PKC δ/θ的抑制剂MTX所抑制。同时我们发现PKC的激活剂Phorbol12-myristate13-acetate （PMA）可以模拟FSH诱导小鼠卵母细胞减数分裂的恢复,而DPI则可以显著抑制PMA的诱导作用。进一步研究发现,FSH处理2h后,卵丘细胞中的TACE的活力显著上升,在4h时TACE的活力上升到最高,然而这种趋势可以被DPI以及DMTU显著抑制。以上结果表明,在FSH诱导的小鼠卵母细胞成熟过程中,PKC δ/θ可能通过调节NADPH脱氢酶的胞质组分p47phox和p67phox的转位,从而调节NADPH脱氢酶的活性,有活性的NADPH脱氢酶产生的ROS调控了TACE的活力。综上所述,PKC δ/θ信号通路对FSH诱导的小鼠卵母细胞减数分裂恢复是必需的。在FSH诱导的小鼠卵母细胞成熟过程中,PKC δ/θ可能通过PKC δ/θ-NOX-ROS-TACE信号通路参与调控卵母细胞减数分裂的恢复。
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标签：肿瘤坏死因子转化酶论文; 脱氢酶论文; 活性氧论文; 卵母细胞成熟论文;