论文摘要
亚健康状态是介于健康与疾病之间的一种动态变化的中间状态,即健康-亚健康-疾病,亚健康与其上游的健康和下游的疾病之间存在移行变化,这种移行变化是双向的,形成健康-亚健康-疾病的动态变化过程,亚健康处于中位,较之健康或疾病更为复杂。表现为人的机体虽然无明确的疾病,但出现活力降低,适应力呈不同程度减退,是介于健康与疾病之间的一种生理功能降低的状态,又称“第三状态”。在此状态下,人们感觉身体和精神上有各种各样的不适应感,做各种医学检查和化验,未发现任何器质性变化。本课题组的大规模亚健康流行病学调查研究表明,疲劳不仅是亚健康状态的重要临床表现之一,也是导致亚健康发生发展的重要原因,疲劳型亚健康是亚健康的主要类型之一。因此,阐明疲劳型亚健康的发生机制,不仅有助于深入亚健康的病因学研究,而且可以采取积极的措施干预疲劳型亚健康的发生发展,会对疲劳型亚健康的防治产生积极的影响,进入良性循环,向健康方向转化。在目前有关疲劳型亚健康的研究中,建立较理想的疲劳型亚健康模型是研究得以深入的关键。然而目前尚未有比较理想、公认的疲劳型亚健康模型,而动物实验作为现代生物医学研究中的一个极为重要的实验方法和手段,具有可控性好、结果易获得、简便性好、容易复制等优点,为研究亚健康的发生、发展规律及防治措施,研制疲劳型亚健康动物模型具有重要的意义。因此,通过制备疲劳型亚健康大鼠模型,利用蛋白质组学的实验技术,着手于整体,全面观察疲劳型亚健康大鼠以及维康颗粒干预后疲劳型亚健康大鼠的血浆蛋白谱变化,为进一步识别疲劳型亚健康的生物标志物,探讨疲劳型亚健康发生发展机制,以及维康颗粒抗疲劳型亚健康的相关作用机制提供研究基础。本课题主要分为二个部分:一、疲劳型亚健康大鼠模型的制备。根据既往本课题组以及国内外的相关研究资料,我们发现疲劳型亚健康的发生与过度劳累、睡眠不足关系密切。因此,我们利用强迫负5%体重力竭游泳复合剥夺睡眠20 h的方法制备疲劳型亚健康大鼠模型,通过力竭游泳时间、血生化指标及组织病理学检查等对该模型进行综合评价。二、维康颗粒对疲劳型亚健康大鼠血浆蛋白谱的影响。观察维康颗粒对疲劳型亚健康的疗效,利用血浆蛋白质组学的实验技术分析疲劳型亚健康大鼠以及维康颗粒干预疲劳型亚健康大鼠后的血浆蛋白谱。第一节疲劳型亚健康大鼠模型的制备目的:制备疲劳型亚健康大鼠模型。方法:实验一:疲劳型亚健康大鼠模型造模方式研究。雄性SPF级SD大鼠32只,体重（220±20）g,按体重随机化分为4组,分别为第1组（n=8,强迫负5%体重力竭游泳复和睡眠剥夺20 h）,第2组（n=8,强迫负5%体重力竭游泳复和睡眠剥夺16 h）,第3组（n=8,强迫负5%体重力竭游泳复和睡眠剥夺12 h）,第4组（n=8,正常对照组）。具体方法为模型组每日9:00,大鼠在水深50 cm、水温24±2℃的玻璃游泳池负5%体重行1次力竭游泳并记录力竭游泳时间,后按时间放入水深1.5 cm小鼠笼（有铁丝网盖住,大鼠不能逃脱且可以自由进食饮水）内。第1、2、3组大鼠分别于13:00、17:00、21:00放入塑料盒内,给予足够的饮食。记录力竭游泳时间和大鼠的行为表现如精神状态、体重、饮食、活动情况,步态、二便,以及爪、鼻唇、耳等色泽。第4组不给予任何干预措施。实验二:疲劳型亚健康大鼠模型造模时间研究。雄性SPF级SD大鼠32只,体重（220±20）g,按体重随机化分4组,分别为正常对照组、1天组（造模1 d）,4天组（造模4 d）、5天组（造模5 d）,每组8只。采用强迫负5%体重力竭游泳复和不完全剥夺睡眠20 h的复合方式制备疲劳型亚健康大鼠模型。具体方法为大鼠在水深50 cm、水温24±2℃的玻璃游泳池负5%体重行1次力竭游泳并记录力竭游泳时间,后放入水深1.5 cm小鼠饲养笼（有铁丝网盖住,大鼠不能逃脱且可以自由进食饮水）内20 h。20 h后将大鼠取出放回常规饲养笼内常规饲养。正常对照组按常规饲养方法饲养,不给予任何干预措施。力竭游泳标准:大鼠鼻尖没入水面持续10 s。记录力竭游泳时间,各组实验结束禁食1天,行血浆生化(包括BUN、CR、UA、TBIL、DBIL、IBIL、ALP、AST、ALT、TP、ALB、HBDH、CK、GLU、CHOL、IDLC、K+、Na+、CL-、Ca2+、Mg、CRP、TG)检查等,取各脏器组织病理学检查。结果:实验一:1、力竭游泳时间:第1组末次力竭游泳时间与首次力竭游泳时间以及第2、3两组末次力竭游泳时间相比,存在统计学差异显著（P＜0.05）;第2组与第3组末次力竭游泳时间相比,存在统计学差异（P＜0.05）。2、一般表现:与第4组相比,第1组大鼠活动能力、反应能力均有显著下降;第2组活动能力、反应能力下降表现不明显;第3组活动能力、反应能力正常。实验二:1、力竭游泳时间:各组间末次力竭游泳时间比较无统计学差异（P＞0.05）;各组首末次力竭游泳时间相比,存在统计学差异（P＜0.05）。2、一般表现:与正常对照组相比,4天组、5天组大鼠活动能力、反应能力均有下降。3、血生化检查结果:除5天组外,其余各组各项生化指标均在正常范围之内。5天组血HBDH、BUN水平与其余各组相比存在统计学差异（P＜0.05）:5天组大鼠血CK、CHOL水平与1天组、正常组相比存在统计学差异（P＜0.05）;5天组AST、ALT、CREA、TG水平与正常组相比存在统计学差异（P＜0.05）。4、病理检查结果:各组各脏器病理检查未见明显异常。结论:在室温22～26℃,相对湿度65%,明暗交替12 h的条件下,采用强迫负重（5%体重）力竭游泳复合剥夺睡眠20 h的造模方法,即大鼠在120 cm×60cm×60 cm,水深50 cm,水温24±2℃的游泳池中强迫负重（5%体重）力竭游泳后剥夺睡眠20 h,连续4 d,即可成功制备疲劳型亚健康大鼠模型。第二节维康颗粒对疲劳型亚健康大鼠血浆蛋白谱的影响实验一:维康颗粒抗疲劳型亚健康的疗效研究目的:观察维康颗粒抗疲劳型亚健康的疗效。方法:雄性SPF级SD大鼠24只,体重（220±20）g,按体重进行随机化分正常对照组、模型组、维康颗粒高剂量组,每组8只。正常对照组:正常饲养,11:00灌胃（生理盐水2ml）,不给予其它任何干预措施。第5 d禁食24 h腹主动脉采血。模型组:每日9:00强迫负重（5%体重）力竭游泳并记录力竭游泳时间,11:00灌胃（生理盐水2ml）,13:00放入水深1.5 cm小鼠饲养笼开始剥夺睡眠,次日9:00取出,持续4天。第5 d强迫力竭游泳后禁食24 h腹主动脉采血。维康颗粒高剂量组:每日9:00强迫负重（5%体重）力竭游泳并记录力竭游泳时间,11:00灌胃给药（相应剂量水溶液2 ml）,13:00放入水深1.5 cm小鼠饲养笼开始剥夺睡眠,次日9:00取出,持续4天。第5 d强迫力竭游泳后禁食24h腹主动脉采血。结果:1、力竭游泳时间:与维康颗粒高剂量组相比,第5 d模型组力竭游泳时间显著减少,有统计学差异（P＜0.05）。2、一般状况:维康颗粒高剂量组活动能力、反应能力明显好于模型组。结论:维康颗粒抗疲劳型亚健康效果显著。实验二:维康颗粒对疲劳型亚健康大鼠血浆蛋白谱的影响目的:观察正常大鼠、疲劳型亚健康大鼠以及维康颗粒干预后疲劳型亚健康大鼠的血浆蛋白谱,发现各组间的差异表达蛋白质斑点,为识别疲劳型亚健康大鼠的血浆生物标志物、探讨疲劳型亚健康发生发展机制以及维康颗粒抗疲劳型亚健康的相关作用机制等研究打下基础。方法:各组大鼠血浆采用丙酮沉淀进行血浆浓缩脱盐、Bradford法进行蛋白定量和同组内样品混合上样的方法后进行双向凝胶电泳。采用硝酸银染色法对凝胶染色,采用Power lookl100图像扫描仪进行扫描,二维图谱分析软件PDQuest 7.1.0进行图像分析差异表达蛋白质斑点的数据信息。结果:2-DE图象进行定性定量差异分析,模型组与正常组蛋白谱比较,有120个点有明显差异,有17个差异点经高剂量维康颗粒治疗后较模型组有明显恢复。结论:大鼠疲劳型亚健康的发生可能与维康颗粒高剂量组大鼠血浆较模型组有明显恢复表达的17个蛋白质斑点相关。
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