论文题目: SARS冠状病毒BJ01株全长cDNA的构建及其转录体感染性观察
论文类型: 硕士论文
论文专业: 预防兽医学
作者: 赵卓
导师: 何维明,秦鄂德
关键词: 冠状病毒,亚克隆,全长分子,感染性转录体
文献来源: 西北农林科技大学
发表年度: 2005
论文摘要: SARS冠状病毒(SARS-CoV)为单股正链RNA病毒,基因组全长约29 700nt,是目前所知的RNA病毒中基因组最大的一类病毒。序列分析表明,SARS病毒明显区别于所有已测序的冠状病毒,其系统发生关系不属于目前已知的3组冠状病毒中的任何一组,为一独立的分支。目前对SARS-CoV的基因组结构与功能、致病的分子机理等了解甚少,反向遗传学技术可为深入开展这一领域的研究提供良好的技术支持。反向遗传学技术是指由病毒的cDNA克隆获取RNA病毒的一项技术,包括病毒基因组全长cDNA克隆的构建和感染性转录体的制备。但由于冠状病毒基因组较大,目前无法直接用PCR技术扩增出全长cDNA分子,而且构建基因组全长cDNA克隆必须使用大容量的载体,这就使全长cDNA克隆的构建较为困难。因此,本研究采用分段克隆、体外拼接及体外转录的策略开展了SARS病毒感染性转录体的制备工作。首先,对RT-PCR扩增SARS病毒基因组长片段cDNA的条件进行了优化。利用RNA制备试剂盒从病毒感染的细胞中提取总RNA,以SuperscriptⅡ进行反转录,合成第一链cDNA,然后用LA DNA Taq聚合酶进行cDNA片段的扩增。反应体系中采用不同的Mg2+、dNTP、引物和模板浓度以及不同的反应参数分别进行长片段cDNA的扩增,最终确定了扩增SARS病毒基因组长片段cDNA的最佳反应体系和参数:10×Buffer(Mg2+,37.5 mmol/L)缓冲液5μL,dNTP(10mmol/L) 2μL, LA Taq聚合酶(2.5U)1μL,上下游引物各1.5μL,模板2μL,加水至50μL。扩增条件为:94℃2min;94℃30s,55℃45s,72℃3.5～7min(依片段长度而定,1kb约需1min),扩增28个循环,每个循环延伸时间递增1s;最后72℃延伸7min,4℃保存。该反应条件具有很好的重复性。其次,对病毒全基因组进行分段扩增和克隆。利用SARS病毒BJ01株基因组序列上的特异酶切位点(BglI)和采用沉默突变引入BglI位点的方法设计了7对引物。扩增的7个cDNA片段其大小分别为1.5kb,2.8kb,4.3kb,3.3kb,6.8kb,4.5kb和6.3kb。同时,在基因组5′端引入T7启动子核心序列,以使其能够进行全长cDNA分子的体外转录。将扩增的覆盖病毒全基因组的7个cDNA片段进行回收纯化后,分别将F1片段克隆至pGEM-T Easy载体,将F2～F6克隆至pCR-XL-TOPO载体,将F7克隆至pWSK29载体构建SARS病毒亚cDNA克隆,并通过序列测定进行阳性克隆的筛选。最终构建出了F1-3-Teasy,F2-6-Topo,F3-17-Topo,F4-10-Topo,F5-1-Topo,F6-7-Topo和F7-pWSK29 7个重组质粒。在此基础上,对7个重组质粒进行大量提取、纯化、酶切和回收。然后分别将F1～F4和F5～F7进行体外连接获得SARS病毒基因组5′和3′端半分子cDNA,并对接头处序列进行了PCR扩增和序列测定。再将5′和3′端半分子cDNA进行体外连接,从而获得了SARS病毒BJ01株基因组全长cDNA分子。以获得的全长cDNA分子为模板直接进行体外转录,转录体转染Vero-E6细胞后每天观察细胞状态。结果在转染后84h,细胞出现空泡、聚集成团、变圆拉网等细胞病变。将收集的病毒培养液上清重新接种Vero-E6细胞进行观察,在72h后也出现相同的细胞病变效应。从出现病变的细胞中提取总RNA,对恢复病毒基因组序列的13 038～14 170nt和27 229～28 332nt两个区段进行RT-PCR扩增和测序,结果均与预期一致。这一结果表明,我们获得了BJ01株病毒的感染性转录体。SARS病毒BJ01株全基因组cDNA克隆及感染性转录体(拯救病毒)的获得为进一步确证SARS病毒毒力相关位点,探讨病毒致病的分子机理,开发嵌合疫苗、减毒疫苗以及构建新型病毒载体奠定了坚实的基础。
论文目录:
中文摘要
英文摘要
第一章 SARS 冠状病毒与动物冠状病毒的分子生物学研究进展
1.1 冠状病毒的一般特性
1.2 冠状病毒的分子生物学特性
1.3 SARS-CoV 与动物冠状病毒相关性比较分析
第二章 冠状病毒感染性全长cDNA 克隆研究进展
2.1 冠状病毒基因组全长cDNA 克隆的构建
2.2 构建冠状病毒感染性全长cDNA 克隆的关键环节
2.3 冠状病毒感染性全长cDNA 克隆的应用
2.4 小结与展望
第三章 SARS 病毒BJ01 株全基因组cDNA 的扩增及亚克隆的构建
3.1 材料
3.1.1 病毒株、细胞株、载体与菌株
3.1.2 工具酶及主要试剂
3.1.3 主要仪器设备
3.1.4 主要培养基及缓冲液
3.2 方法
3.2.1 引物设计与合成
3.2.2 总RNA 的提取
3.2.3 反转录合成第一链cDNA
3.2.4 长链PCR 扩增条件的优化
3.2.5 病毒基因组cDNA 的分段扩增
3.2.6 感受态细胞的制备与转化
3.2.7 重组质粒的筛选与鉴定
3.2.8 重组质粒的序列测定与分析
3.3 结果
3.3.1 SARS 病毒 BJ01 株cDNA 片段的长链 PCR 扩增条件的优化
3.3.2 BJ01 株病毒全基因组cDNA 的分段扩增
3.3.3 BJ01 株病毒基因组亚cDNA 克隆的构建与鉴定
3.3.4 BJ01 株病毒基因组亚cDNA 克隆的序列测定
3.4 讨论
第四章 SARS 病毒 BJ01 株全长cDNA 的构建及其转录体感染性观察
4.1 材料
4.1.1 重组质粒与细胞株
4.1.2 主要试剂
4.1.3 主要仪器设备
4.1.4 主要试剂及培养基的配制
4.2 方法
4.2.1 重组质粒的大量提取和纯化
4.2.2 目的基因片段的制备
4.2.3 病毒基因组半分子cDNA 的体外构建与鉴定
4.2.4 全长cDNA 分子的体外连接与鉴定
4.2.5 全长cDNA 分子的体外转录及转录体感染性观察
4.3 结果
4.3.1 SARS-CoV BJ01 株基因组cDNA 片段的制备
4.3.2 BJ01 株病毒基因组5′和3′端半分子cDNA 的构建与鉴定
4.3.3 BJ01 株病毒基因组全长cDNA 分子的体外连接与鉴定
4.3.4 SARS 病毒基因组全长cDNA 体外转录体的制备及其感染性观察
4.3.5 恢复病毒的分子生物学鉴定
4.4 讨论
总结
参考文献
致谢
作者简介
发布时间: 2007-11-15
参考文献
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