论文摘要
研究背景镁是一种生物可降解金属材料,但纯镁降解速率过快,产生大量氢气,临床应用受到了限制。随着合金技术的发展以及表面改性方法的应用,可降解镁合金的耐蚀性能和生物相容性有了极大的改善。尽管镁合金具有良好的生物相容性,但是其降解速度仍较快,为了进一步减缓合金的降解速度,学者们进行了一系列合金表面改性研究,形成了不同类型的合金涂层,不仅起到延缓降解的作用,而且还改善了其生物相容性。目前研究较多的有钙磷涂层、氟化物涂层等。但是作为骨科植入材料,其对于骨组织再生有无影响,将决定其是否能够成为一种好的骨修复材料。对于骨再生过程中的关键细胞-成骨细胞和骨髓间充质干细胞的生物学行为及成骨分化过程有无影响尚不明确,对于骨骼运动的主要动力装置一骨骼肌细胞的生物学行为影响也不明确。本研究拟针对上述问题,以空白或钛合金为对照,对镁合金、钙磷涂层镁合金、氟涂层镁合金进行进一步的研究,研究镁合金及其涂层对成骨生物学的初步影响,明确其材料的表面性质、明确其对成骨细胞生物学行为的影响,进而明确其植入体内后的血清镁及局部骨骼的变化,明确其对骨骼肌细胞的生物影响,明确其对骨髓间充质干细胞生物学行为及成骨分化的影响。目的1、明确镁合金及其涂层的表面形态及性质2、明确镁合金及其涂层对成骨细胞的生物学行为的影响3、明确镁合金及其涂层植入体内后的血清镁变化、材料降解及成骨情况4、明确镁合金及其涂层对骨骼肌细胞的生物学行为的影响5、明确镁合金及其涂层对骨髓间充质干细胞的生物学行为的影响6、明确镁合金及其涂层对骨髓间充质干细胞成骨分化的影响研究方法1、采用扫描电镜研究镁合金AZ31B、钙磷涂层镁合金CaP-AZ31B、氟涂层镁合金F-AZ31B的表面形态,用能谱分析研究其元素组成；通过将镁合金及其涂层浸入细胞培养基中获得浸提液,测定浸提液的PH值变化情况；通过蛋白吸附实验研究镁合金及其涂层对蛋白的吸附能力。2、通过采用镁合金、钙磷涂层镁合金及氟涂层镁合金的浸提液培养成骨细胞,进而研究其细胞2、6及24小时的细胞黏附率,采用扫描电镜研究其黏附形态,采用倒置显微镜观察1、3、5、7天细胞形态,采用CCK法检测成骨细胞1、3、5、7天增殖活力,采用Calcein-AM和EthD-1双染观察浸提液培养24小时后的细胞存活情况,通过1、3、5、7天的磷酸酶测定及1、3、5、7天的细胞内总蛋白测定来研究镁合金及其涂层对成骨细胞功能的影响。3、通过将镁合金组、钙磷涂层镁合金组和聚乳酸对照组3组材料植入兔股骨,术后观察兔子的大体行为及术后24小时、1周、4周、6周和8周的血清镁浓度变化；术后8周处死实验动物,通过大体形态、CT扫描及三维重建观察植入材料的形态学变化情况；通过组织学观察成骨情况；通过扫描电镜观察镁合金及骨界面处的降解情况。4、通过采用镁合金、钙磷涂层镁合金及氟涂层镁合金的浸提液培养骨骼肌细胞,进而研究其细胞2、6及24小时的细胞黏附率,采用扫描电镜研究其黏附形态,采用倒置显微镜观察1、3、5、7天细胞形态,采用CCK法检测骨骼肌细胞1、3、5、7天增殖活力,采用细胞凋亡试剂盒检测各组细胞有无凋亡,采用Calcein-AM和EthD-1双染观察浸提液培养24小时后的细胞存活情况,采用1、3、5、7天细胞内总蛋白测定来研究镁合金及其涂层对骨骼肌细胞功能的影响。5、从志愿者身上抽取骨髓,进行骨髓间充质干细胞的分离培养,通过免疫组织化学方法鉴定骨髓间充质干细胞；通过采用镁合金、钙磷涂层镁合金及氟涂层镁合金的浸提液培养骨髓间充质干细胞胞,进而研究其细胞2、6及24小时的细胞黏附率,采用扫描电镜研究其黏附形态,采用倒置显微镜观察1、3、5、7天细胞形态,采用CCK法检测骨髓间充质干细胞1、3、5、7天增殖活力,采用Calcein-AM和EthD-1双染观察浸提液培养24小时后的细胞存活情况。6、通过镁合金、钙磷涂层镁合金及氟涂层镁合金置入成骨诱导液中获得成骨诱导浸提液,进而采用不同的成骨诱导液进行骨髓间充质干细胞的成骨分化诱导,通过细胞收集、引物设计、细胞RNA的提取以及逆转录等过程,以P-actin基因为内参,于成骨分化诱导后第6天和第12天研究各种浸提液中ALP、 COL I、OC、OPN和RUNX2基因的表达情况。7、根据不同的数据类型,分别采用采用One-Way ANOVA、析因设计方差分析、重复测量方差分析及独立样本t检验进行统计学分析,多重比较应用LSD法,方差不齐时采用Dunnetts T3比较。检验水准α=0.05。结果1、表面形态及性质1.1表面形态：镁合金表面形态光滑,钙磷涂层镁合金表面形态粗糙,可见大量的钙磷物质沉积及晶体状结构,氟涂层镁合金表面表面均匀、光滑,在涂层表面可见分布有少数不规则小孔。1.2能谱分析：结果表明镁合金表面主要有镁、铝、锌组成,其中镁元素原子百分比约为96%,铝约为3%,锌约为1%；钙磷涂层镁合金CaP-AZ31B表面主要有镁、钙、磷及氧组成,其中镁元素原子百分比约为0.33%,氧为63.39%,磷为17.6%5,钙为18.63%；氟涂层镁合金F-AZ31B表面主要是镁、氟、铝及锌,其中镁元素原子百分比约为56%,氟元素约为42.34%,铝约为1.27%,锌约为0.47%。1.3浸提液的PH值变化情况：随着时间的延长,镁合金AZ31B、钙磷涂层镁合金CaP-AZ31B、氟涂层镁合金F-AZ31B溶液的PH值都发生了改变,其逐渐向碱性环境转化,但是镁合金AZ31B浸提液的PH值升高最为显著,远氟涂层镁合金F-AZ31B溶液的PH值改变不显著,钙磷涂层镁合金CaP-AZ31B溶液的PH值改变介于二者之间。1.4蛋白吸附能力：镁合金的蛋白吸附能力较钛合金低,氟涂层的蛋白吸附能力较镁合金稍高,钙磷涂层镁合金的蛋白吸附能力较其他三组显著增高（P<0.05）,四组的蛋白吸附能力分别为26.95±3.17、25.27±2.02、70.2±5.57、27.70±2.00ug/ml。2、对成骨细胞的生物学行为的影响2.1早期细胞黏附率：四组材料表面MC3T3-El细胞粘附率之间有显著差异（F=259.434,P=0.000）,组间比较显示钙磷涂层镁合金组细胞粘附率显著高于其他三组（P<0.05）,而镁合金组细胞粘附率显著低于其他三组（P<0.05）,其他两组间无显著差异（P>0.05）。针对同组材料三个不同时间点MC3T3-El细胞粘附率比较均具有显著差异（P值均<0.05）。四组之间细胞黏附率CaP-AZ31B组>F-AZ31B组>钛合金组>AZ31B组。加入四组材料浸提液后不同时间点MC3T3-El细胞粘附率有显著差异（F=630.231,P=0.000）,随着时间的延长,四组材料浸提液MC3T3-El细胞粘附率显著增加,不同时间点两两比较均有显著统计学差异（P<0.05）。且同一时间点四组材料浸提液MC3T3-El细胞粘附率比较差异均具有的统计学意义（P均<0.05）其中所有组合交互效应均显著（F=21.78,P=0.000）。结合基本统计量输出结果,最大均值（62.8%）的组合为培养24h时CaP-AZ31B组MC3T3-El细胞粘附率,最小均值（24.0%）为培养2h时AZ31B细胞粘附率。2.2细胞黏附形态观察成骨细胞在三组材料表面黏附较好,镁合金及其涂层表面成骨细胞贴壁展开,形态不规则,大多呈梭形,有较多突起,部分细胞间突起相互连接。2.3细胞增殖活力加入四组材料浸提液培养后不同时间点细胞增殖活力比较有显著差异（F=1491.2,P=0.000）；镁合金及其涂层合金浸提液培养的细胞活力均随着培养时间的延长而增加,任两个不同时间其细胞活力比较差异均具有显著的统计学意义。镁合金及其涂层合金浸提液培养的细胞活力四组总体比较具有显著差异（F=143.6,P=0.000）,多重比较显示四组间任何两组比较其差异均具有显著统计学意义,且总体F-AZ31B组增殖活力最大,其次是钛合金组,CaP-AZ31B组次之,AZ31B组细胞增殖活力最小。其中所有组合交互效应均显著（F=9.15,P=0.000）。2.4相对增殖率镁合金组的相对增殖率在四个时间点均小于80%,说明镁合金有一定毒性,按照毒性评级为2级,但钙磷涂层镁合金组培养的MC3T3-El细胞相对增值率均>80%,毒性评级为1级,氟涂层镁合金组培养的MC3T3-El细胞相对增值率均>100%,毒性评级为0级,为临床骨科植入材料所接受。采用析因设计的方差分析结果显示：镁合金及其涂层合金浸提液培养的细胞在不同时间上细胞增殖率无显著差异（F=0.725,P=0.541）；且各个时间点之间两两比较差异均无统计学意义（P>0.05）。镁合金及其涂层合金浸提液培养的细胞增殖率四组间总体比较具有显著差异（F=534.57,P=0.000）；3个试验组的细胞增殖率均显著低于对照组,四组间细胞增值率两两比较均有显著差异,且从均值上看,其细胞增值率对照组>CaP-AZ31B组>F-AZ31B组>AZ31B组。且培养时间及浸提液之间交互效应显著（F=2.01,P=0.048）。2.5荧光染色见镁合金浸提液组培养的成骨细胞可见少量细胞红染,但绝大多数细胞仍具有活性（绿染）,钙磷涂层镁合金及氟涂层镁合金组浸提液培养的细胞无明显红染。2.6碱性磷酸酶定量随着培养时间的延长,镁合金及其涂层合金浸提液培养的细胞碱性磷酸酶表达均呈上升趋势,差异具有统计学意义（F=1330.7,P=0.000）,且各个时间点之间两两比较均具有显著差异（P<0.05）。镁合金及其涂层合金浸提液培养的细胞碱性磷酸酶表达水平四组间总体比较具有显著差异（F=407.3,P=0.000）;且多重比较结果显示任两组浸提液培养的细胞碱性磷酸酶差异均显著,且从均值上看,四组的碱性磷酸酶表达量依次为CaP-AZ31B组>F-AZ31B组>对照组>AZ31B组。培养时间及细胞碱性磷酸酶表达水平之间交互效应显著（F=25.8,P=0.000）。2.7细胞内总蛋白镁合金及其涂层合金浸提液培养的细胞胞内总蛋白量随着培养时间的延长而增加,差异具有显著统计学意义（F=851.6,P=0.000）；且各个时间点之间两两比较其细胞内总蛋白量均有显著差异（P<0.05）。镁合金及其涂层合金浸提液培养的细胞胞内总蛋白量四组间总体比较具有显著差异（F=4120.7,P=0.000）;且多重比较结果显示任两组浸提液培养的细胞碱性磷酸酶差异均显著,且从均值上看,四组浸提液培养的细胞胞内总蛋白量依次为CaP-AZ31B组>F-AZ31B组>对照组>AZ31B组。培养时间及细胞胞内总蛋白量之间交互效应显著（F=30.9,P=0.000）。3、骨植入实验3.1术后兔子一般情况良好,术后各个时间点的血清镁均在正常范围内。3.2植入八周后聚乳酸几乎完全降解,并且植入处与新生骨贴合紧密。镁合金及钙磷涂层镁合金基本都维持较好的完整形态,其中镁合金骨质外部分可见少许降解,边界不清晰、不规则,钙磷涂层镁合金材料边界清晰,未见到明显降解痕迹。3.3钙磷涂层镁合金组金属与骨界面出可见较多新生骨形成,骨小梁排列紧凑而规则。无涂层镁合金形成的新生骨较少。同时可见无涂层样品的扫描电镜提示其边缘不规则,发生了降解,但钙磷涂层镁合金边缘形状同植入前变化很小。4、对骨骼肌细胞的生物学行为的影响4.1骨骼肌细胞黏附率测定四组材料表面兔骨骼肌细胞细胞粘附率之间有显著差异（F=157.11,P=0.000）,组间比较显示钙磷涂层镁合金组细胞粘附率显著高于其他三组,而镁合金组细胞粘附率显著低于其他三组,其他两组间无显著差异。四组之间细胞黏附率CaP-AZ31B组>F-AZ31B组>钛合金组>AZ31B组。加入四组材料浸提液后不同时间点兔骨骼肌细胞粘附率有显著差异（F=874.783,P=0.000）,随着时间的延长,四组材料浸提液兔骨骼肌细胞粘附率显著增加,不同时间点两两比较均有显著统计学差异（P<0.05）。其中时间与浸提液交互效应均显著（F=10.61,P=0.000）。4.2细胞黏附形态兔骨骼肌细胞在镁合金、钙磷涂层镁合金及氟涂层镁合金三组材料表面均表现黏附较好。4.3细胞增殖活力加入四组材料浸提液培养后不同时间点细胞增殖活力比较有显著差异（F=2022.53,P=0.000）；镁合金及其涂层合金浸提液培养的细胞活力均随着培养时间的延长而增加,任两个不同时间其细胞活力比较差异均具有显著的统计学意义。镁合金及其涂层合金浸提液培养的细胞活力四组总体比较具有显著差异（F=50.68,P=0.000）,多重比较显示四组间任两组比较其差异显著（P<0.05）,且总体CaP-AZ31B组增殖活力最大,其次是F-AZ31B及钛合金组,AZ31B组细胞增殖活力最小。其中所有组合交互效应均显著（F=5.43,P=0.000）。4.4相对增殖率镁合金组的相对增殖率在第5及7d两个时间点小于80%,说明镁合金有一定毒性,毒性评级为2级,但钙磷涂层镁合金及氟涂层镁合金组培养的骨骼肌细胞相对增殖率均>90%,毒性评级为1级,为临床骨科植入材料所接受。采用析因设计的方差分析结果显示：镁合金及其涂层合金浸提液培养的细胞在不同时间上细胞增殖率有统计学差异（F=3.56,P=0.018）；且各个时间点之间比较,除第1d和第5d,第1d和第7d细胞增值率有显著差异（P<0.05）外,其余各时间点间比较均无显著差异（P>0.05）。镁合金及其涂层合金浸提液培养的细胞增殖率四组间总体比较具有显著差异（F=217.94,P=0.000）；3个试验组的细胞增殖率均显著低于对照组,四组间细胞增值率两两比较均有显著差异,且从均值上看,其细胞增值率对照组>CaP-AZ31B组>F-AZ31B组>AZ31B组且培养时间及浸提液之间无交互作用（F=0.69,P=0.71）。4.5细胞凋亡检测镁合金浸提液可引起骨骼肌细胞凋亡,对照组、钙磷涂层镁合金组以及氟涂层镁合金组流式细胞图未见明显细胞凋亡。4.6荧光染色可镁合金浸提液组培养的骨骼肌细胞可见部分细胞红染,钙磷涂层镁合金及氟涂层镁合金浸提液培养的骨骼肌细胞活性较好,如对照组一样,未见明显细胞红染。4.7细胞内总蛋白镁合金及其涂层合金浸提液培养的细胞胞内总蛋白量随着培养时间的延长而增加,差异具有显著统计学意义（F=1796.8,P=0.000）；且各个时间点之间两两比较其细胞内总蛋白量均有显著差异（P<0.05）。镁合金及其涂层合金浸提液培养的细胞胞内总蛋白量四组间总体比较具有显著差异（F=136.45,P=0.000）；且多重比较结果显示：除CaP-AZ31B组与F-AZ31B组细胞内总蛋白量比较无显著差异（P>0.05）外,其他各组间细胞内总蛋白量差异均显著,且从均值上看,四组浸提液培养的细胞胞内总蛋白量依次为对照组>CaP-AZ31B组>F-AZ31B组>AZ31B组。培养时间及细胞胞内总蛋白量之间交互效应显著（F=7.15,P=0.000）。5.对骨髓间充质干细胞的生物学行为的影响5.1骨髓间充质干细胞鉴定流式细胞仪细胞仪检测结果提示CD34-、CD45-、CD44+、CD73+、CD90+、 CD105+。5.2骨髓间充质干细胞黏附四组材料表面兔骨骼肌细胞细胞粘附率之间有显著差异（F=259.43,P=0.000）,组间比较显示钙磷涂层镁合金组细胞粘附率显著高于其他三组,而镁合金组细胞粘附率显著低于其他三组,氟涂层与钛合金组比较两组间无显著差异。四组之间细胞黏附率CaP-AZ31B组>F-AZ31B组>钛合金组>AZ31B组。加入四组材料浸提液后不同时间点骨髓间充质干细胞粘附率有显著差异（F=630.23,P=0.000）,随着时间的延长,四组材料浸提液骨髓间充质干细胞粘附率显著增加,不同时间点两两比较均有显著统计学差异（P<0.05）。其中时间与浸提液交互效应显著（F=21.78,P=0.000）。5.3细胞增殖镁合金及其涂层合金浸提液培养的细胞在不同时间上细胞增殖能力比较,结果显示：加入浸提液培养后不同时间点细胞增殖活力比较有显著差异（F=399.91,P=0.000）;镁合金及其涂层合金浸提液培养的细胞增殖能力均随着培养时间的延长而增加,任两个不同时间其细胞增殖能力比较差异均具有显著的统计学意义。镁合金及其涂层合金浸提液培养的细胞增殖能力四组总体比较具有显著差异（F=37.14,P=0.000）,多重比较显示镁合金组细胞增殖能力均显著低于其他四组,钙磷涂层及氟涂层镁合金的细胞增殖能力较无涂层显著改善,显著优于镁合金组,与钛合金组无显著差异,且总体钙磷涂层镁合金组增殖活力最大,其次是钛合金组,氟涂层镁合金组次之,镁合金组细胞增殖活力最小。对镁合金降解液存在的PH升高问题,调节PH值组镁合金浸提液的细胞增殖能力与钛合金组、和钙磷涂层及氟涂层镁合金无显著差异（P>0.05）。其中时间降解液交互效应均显著（F=2.32,P=0.011）。五组荧光结果提示均可见到绿色染色的细胞,未见到明显的红色染色细胞。6、对骨髓间充质干细胞成骨分化的影响提取的RNA较完整,纯度较高。RT-PCR结果提示：钙磷涂层镁合金对于COLI基因、ALP基因以及OC基因表达有促进作用。RUNX2基因表达量四组间无显著差异。镁合金组的ALP表达量较低,调节PH值后ALP表达量与空白对照组无显著差异（P>0.05）,镁合金的OPN基因表达量在诱导分化后第6天和第12天均显著高于其余三组（P<0.05）,调整PH值后的OPN基因表达量与对照组无显著差异（P>0.05）,提示PH值是引起镁合金对于ALP基因和OPN基因的表达影响的可能因素之一。结论1、镁合金AZ31B及氟涂层镁合金F-AZ31B表面光滑,钙磷涂层镁合金CaP-AZ31B表面粗糙,可见晶体状结构。2、三组镁合金浸提液的PH值均出现增高,但氟涂层镁合金性质最为稳定,单纯镁合金溶液的PH值升高显著。3、钙磷涂层镁合金对于蛋白具有更好的吸附能力,镁合金及氟涂层镁合金及钛合金对于蛋白吸附能力无显著差异。4、镁合金对于成骨细胞存在2级毒性反应,钙磷涂层镁合金及氟涂层镁合金对于成骨细胞有着良好生物相容性。5、镁合金及其钙磷涂层体内生物相容性良好,血清镁的浓度均为正常范围内；钙磷涂层有效地延缓了镁合金的降解,并可以促进成骨作用。6、镁合金对于骨骼肌细胞存在2级毒性反应,钙磷涂层镁合金及涂层镁合金对于骨骼肌细胞有着良好生物相容性。7、镁合金对于骨髓间充质干细胞存在2级毒性反应,钙磷涂层镁合金及涂层镁合金对骨髓间充质干细胞有着良好生物相容性。8、钙磷涂层镁合金对于COLI、ALP及OC基因表达有促进作用,无涂层镁合金抑制ALP的表达,且促进OPN基因的表达,但是调节PH值后重复研究发现其与对照组无显著差异,提示其影响可能与PH值有关。
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