Caspase-3凋亡通路参与神经病理性疼痛及其相关机制的研究

论文摘要

目的及研究背景:慢性疼痛被广泛地定义为急性组织损伤修复后疼痛超过1个月、疼痛持续或反复发作超过3个月以上或与组织损伤有关的疼痛预计持续存在或加重。慢性疼痛近来逐年增加,已经成为一个主要的社会、经济负担,全世界有超过3亿2千万的人受其影响。疼痛患者通常分为以下几类:术后疼痛、癌痛、后背痛、HIV疼痛、神经病理性疼痛、关节痛和偏头痛。依原始刺激的时程和自然特性,疼痛分为3个不同时期,第一期:急性疼痛期,是对简单、短暂的伤害性刺激物的处理过程,是单纯、直接由外周向丘脑及皮层中枢的传递过程。外周感受器的放电与主观疼痛的感知之间有着密切的联系。第二期:炎症性状态期,由持续长时间伤害性刺激所形成,导致组织损伤和外周的炎症反应,机体出现自发性疼痛、痛觉过敏以及超敏反应（将正常的非伤害性刺激认为疼痛）。第三期:神经病理性状态期,为外周神经或CNS损害的结果,包括外周的神经病理状态和中枢的疼痛状态,此时的疼痛与原发的损伤无关。尤其要指出的是这3个时期之间并不排斥,在某些特定的神经病理状态下可以共存。神经病理性疼痛以自发性疼痛、痛觉过敏以及超敏反应为特点,通常由外周神经、背根神经节、脊髓或脑的损伤所致,包括了疼痛的第二、第三期。神经病理性疼痛目前仍然是一个棘手的临床问题,主要是对其病理过程了解不全。近年来,有研究表明,凋亡对于细胞损伤及神经病理性疼痛具有重要意义。形态学的研究,在神经病理性疼痛的大鼠脊髓浅层及在外周神经损伤的脊髓上同时存在细胞凋亡的现象。在神经病理性疼痛的大鼠上,bcl-2家族基因表达的改变可调节细胞死亡。我们推测在细胞死亡前有较长的一段凋亡期,但是否是凋亡相关基因在脊髓的表达导致神经病理性疼痛的发生目前仍不清楚。细胞凋亡（apoptosis）是一个细胞自我破坏的程序性生化过程,形态学特征是细胞核和细胞质发生浓缩,在多种的疾病中都起重要作用。凋亡的中心环节是蛋白裂解系统,包括半胱氨酰蛋白酶家族,称半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（caspase）。caspases分为两类:一类是上游启动者（initiators）caspases,如caspase8、9,可裂解并激活其它caspase;另一类是下游效应者（effectors）caspases,主要包括caspase-3、6、7,可裂解各种底物,分解细胞结构或使酶失活。而caspase-3作为“刽子手”蛋白酶,在其中起关键作用。Vitode Novellis等的研究发现大鼠坐骨神经结扎后凋亡通路激活,阻断谷氨酸mGlu5受体可防止凋亡基因在脊髓的过表达。但Erika的研究却指出在SNI模型中,脊髓背角神经元的死亡并不是机械性超敏反应所必需的。因此,凋亡通路是否参与外周神经病变后的疼痛还需进一步证实。某些神经病理性疾病与线粒体功能障碍有关,而线粒体功能障碍与凋亡关系密切。线粒体依赖性的凋亡可被许多因素激活,如活性氧（reactive oxygen species,ROS）、神经酰胺、一氧化氮。这些因素可导致线粒体释放细胞色素C,而后形成细胞色素C、凋亡蛋白酶激活因子1和caspase-9复合体,从而裂解并激活下游的效应者caspases。氧化应激可损伤组织、蛋白、DNA和脂质。ROS是激活caspase,引起线粒体功能障碍的关键因素,ROS参与NMDA受体激活,而大鼠CCI模型上凋亡的发生又是谷氨酸依赖性,这就建立起ROS与凋亡的联系。反之,广谱的抗凋亡蛋白如BCL-2又有抗氧化作用,通过直接清除ROS或上调其它ROS清除剂如硫醇复合物或抗氧化蛋白酶,这也进一步证明ROS的产生是启动凋亡的关键之一。ROS和凋亡都同神经病理性疼痛有关表明两者之间具有某种联系。由于ROS清除剂可缓解疼痛,而且ROS是诱导凋亡的重要步骤,有理由推测ROS可快速诱导脊髓凋亡基因的过表达,并发挥其在疼痛的发展中的重要作用。肿瘤坏死因子（tumour necrosis factor,TNF）家族受体同样可诱导凋亡。TNF-a作用于感觉神经元,在炎症性疼痛中起重要作用;神经酰胺,作为TNF-a的第二信使,可增强神经元的兴奋性。TNF-a可通过多种不同方式激活细胞内的多种信号转导通路。连接并聚合TNF-R1可导致某些adapter信号蛋白的聚集,其中之一即Fas相关的死亡区域蛋白（Fas-associated death domain protein,FADD）。FADD可聚集前caspase-8分子并激活可自我放大的caspase级联反应,该效应为细胞凋亡的必需环节。研究表明,抑制caspase可减轻TNF-a诱导的痛觉过敏;抑制TNF-a的第二信使神经酰胺,可同时抑制痛觉过敏和细胞凋亡。因此,我们有理由假设,caspase信号转导通路所引起的痛觉相关的行为学改变可能是由TNF-a所诱导的。当然,还要一个问题需要解决,那就是神经元凋亡后为何超敏反应还持续存在,因为众所周知,痛觉信号是由神经元传递。芽生（sprouting）,是神经损伤的结果,通常伴有强烈的胶质细胞反应。在此,我们假设芽生可能是神经元凋亡后神经病理性疼痛持续存在的机制。有证据表明,激活的星形胶质细胞在清除损伤突触、重新连接神经断端及芽生中起重要作用。在神经元的断端,星形胶质细胞激活,突触发生替换,同时,在与断端不相邻的远处的中枢神经系统的神经元也发生了替换。在中枢初级传入神经元的周围胶质细胞迅速激活。神经纤维在分裂的星形胶质细胞的传送下,在脊髓内生长,形成生长区带。研究表明,激活的星形胶质细胞至少可以通过两种方式促进芽生:①通过清除轴突碎片,减少髓鞘对芽生的阻碍而促进芽生;②通过释放细胞因子和生长因子调控芽生。研究表明,两种细胞因子IL-1和IL-6可调节胶质细胞的反应,并在调节神经元芽生中具有重要作用。IL-1可调节胶质细胞增殖,引导营养因子作用于新生的神经纤维。而IL-6则诱发新生纤维向外继续生长。因此,推测在凋亡时或凋亡后,大直径、厚髓、低阈值的Aa纤维或交感神经纤维可能芽生入脊髓浅层,包括Ⅰ和Ⅱ层。中小直径的、薄髓、高阈值的Ad纤维可能被低阈值Aa纤维或交感神经纤维替代,导致超敏反应的发生。鉴于caspase-3在神经病理性疼痛中的作用,阻断该通路可能成为治疗疼痛的新方法。RNA干扰是一种抑制基因表达的新方法,一系列相关的临床前的研究都在开展。RNA干扰主要细胞浆中执行,采用非病毒载体易于达到该目的,但是要被细胞有效的摄入并实现长期、稳定的表达是比较困难的。目前更倾向于在哺乳动物细胞内表达siRNA,以维持长久的RNA干扰效应。而利用腺病毒表达干扰RNA,因其在体内的存在时间更长,而且,腺病毒的转染效率比单纯的siRNA或质粒介导的表达载体的转染效率要高得多,可大大增强体内实验的干扰效率。腺病毒的宿主范围广,可将外源基因转入静止的非分裂的细胞。有学者利用腺病毒介导小RNA在体内外实验都可抑制葡苷酸酶,说明腺病毒介导RNA的表达有一定的可行性。因此,在本研究中,我们将构建表达caspase-3小RNA的腺病毒,并观察其对CCI大鼠痛觉过敏反应的影响。方法:1.坐骨神经结扎大鼠脊髓背角细胞凋亡的研究（1）大鼠分成2组:假手术组（Sham组）和手术组（CCI组）。术后1d、3d、7d、10d、14d不同的时间点测定坐骨神经结扎大鼠的热痛阈,并采用免疫荧光方法测定caspase-3的表达,TUNEL原位末端标记法检测脊髓神经细胞的凋亡。（2）caspase-3抑制剂Z-DEVD-FMK及caspase家族抑制剂Z-VAD-FMK阻断凋亡通路对CCI的影响。手术当日及术后在大鼠疼痛同侧的后肢脚底皮内每日1个单位分别注射caspase-3抑制剂Z-DEVD-FMK及caspase家族抑制剂Z-VAD-FMK,连续注射5d,观察比较大鼠热痛阈的变化,同时观察凋亡指标。2.TNF-α、ROS参与CCI大鼠神经元凋亡的研究（1）大鼠分成2组:假手术对照组和手术组,手术组随机分为2个亚组,N-乙酰半胱酸组（NAC组）、生理盐水（NS组）。实验前禁食12h,自由饮水。NAC组于麻醉后、结扎前腹腔注射NAC 300 mg/kg,而后每日注射NAC 300 mg/kg,生理盐水组注射等量生理盐水。（2）术后1d、3d、7d、10d、14d不同的时间点测定坐骨神经结扎大鼠的热痛阈,采用ELISA检测脊髓TNF-α的表达、并对脊髓SOD表达进行测定。同时采用免疫荧光方法测定caspase-3的表达,TUNEL原位末端标记法检测脊髓神经细胞的凋亡。3.CCI大鼠脊髓背角神经元凋亡、星形胶质细胞激活促进芽生形成介导神经病理性疼痛的研究。（1）caspase-3抑制剂Z-DEVD-FMK及caspase家族抑制剂Z-VAD-FMK阻断通路。术后在大鼠疼痛同侧的后肢脚底皮内隔日注射caspase-3抑制剂Z-DEVD-FMK及caspase家族抑制剂Z-VAD-FMK,观察比较大鼠热痛阈的变化,同时观察凋亡指标。用westernblotting及免疫荧光方法测定GAP-43的表达,观察芽生情况。（2）用药物丙戊茶碱抑制星形胶质细胞激活。术后在大鼠疼痛鞘内每日注射胶质细胞抑制剂丙戊茶碱,用GFAP抗体进行免疫组化,观察星形胶质细胞激活,并用ELISA方法检测IL-1β的表达,同时观察疼痛及测定GAP-43的表达。4.腺病毒介导的小RNA干扰caspase-3对CCI大鼠的抗伤害性刺激作用（1）体外筛选caspase-3小RNA的有效序列。应用经典的克隆方法,首先克隆大鼠caspase-3基因,将caspase-3基因与含EGFP的质粒pEGFP-C1重组,构建报告载体pEGFP-Cas3,对3个不同表达caspase-3小RNA的质粒pShuttleH1-siCas3进行筛选,通过Lipofectamine2000将pShuttleH1-siCas3及体pEGFP-Cas3共转染HEK-293细胞株,倒置相差显微镜和流式细胞仪观察EGFP的荧光强度。（2）采用分子克隆的方法构建表达caspase-3小RNA的腺病毒,并观察其对体外培养神经元凋亡的影响。（3）caspase-3小RNA及重组腺病Ad-SiCas3鞘内注射对CCI大鼠热痛阈的影响。caspase-3小RNA在术前1d开始鞘内注射,20μg/d,连续7d;重组腺病毒Ad-SiCas3单次注射,采用real time PCR及western blotting的方法检测caspase-3 mRNA及其蛋白。并观察比较大鼠热痛阈的变化。结果:1.坐骨神经结扎大鼠脊髓背角细胞凋亡的研究（1）大鼠坐骨神经结扎后,右足热痛阈明显降低,与左足相比,具有明显的差异（P＜0.05）,免疫荧光显示结扎侧脊髓背角caspase-3的表达明显高于未结扎侧,TUNEL法显示结扎侧脊髓背角凋亡的细胞明显高于未结扎侧。（2）caspase-3抑制剂Z-DEVD-FMK及caspase家族抑制剂Z-VAD-FMK注射后,caspase-3的表达明显降低,大鼠热痛阈明显增高,与NS组相比差异显著（P＜0.05）,与Sham组相比无显著差异（P＞0.C5）。停止注射后,大鼠热痛阈降低,与NS组相比差异显著（P＜0.05）,与CCI组相比无显著差异（P＞0.05）。2.TNF-α、ROS参与CCI大鼠神经元凋亡的研究。（1）坐骨神经结扎后脊髓TNF-α的表达增加,与CCI组相比差异显著（P＜0.05）。脊髓SOD表达下降,在第7天上与CCI组相比差异显著（P＜0.05）,其它时间点无显著差异（P＞0.05）。（2）NAC组脊髓caspase-3的表达及TUNEL阳性神经元数与NS组相比,明显下降（P＜0.05）,在施加干预后,NAC组右足热痛阈明显升高,而NS组无明显变化,两者比较有统计学意义（P＜0.05）。3.CCI大鼠脊髓背角神经元凋亡、星形胶质细胞激活促进芽生形成介导神经病理性疼痛的研究。（1）caspase-3抑制剂Z-DEVD-FMK及caspase家族抑制剂Z-VAD-FMK注射后,caspase-3的表达明显降低,大鼠热痛阈明显增高,与NS组相比差异显著（P＜0.05）,与Sham组相比无显著差异（P＞0.05）。停止注射后,大鼠热痛阈降低,与NS组相比差异显著（P＜0.05）,与CCI组相比无显著差异（P＞0.05）。GAP-43的表达明显降低（P＜0.05）。（2）注射后丙戊茶碱,大鼠热痛阈明显增高,GFAP的表达明显下降,与NS组相比差异显著（P＜0.05）。IL-1及GAP-43的表达明显下降与NS组相比差异显著（P＜0.05）。4.腺病毒介导的小RNA干扰caspase-3对CCI大鼠的抗伤害性刺激作用（1）成功构建报告载体pEGFP-Cas3及3个质粒pShuttleH1-siCas3。共转染HEK-293细胞株,倒置相差显微镜和流式细胞仪均可见EGFP的荧光强度被明显抑制,其中,以pShuttleH1-siCas3Ⅱ的干扰效果最佳。（2）Ad-siCas3能够较好抑制caspase-3 mRNA的表达,抑制内毒素诱导的神经元细胞凋亡。（3）caspase-3小RNA或Ad-siCas3鞘内注射后大鼠热痛阈明显增高（P＜0.05）,caspase-3 mRNA及其蛋白的表达下降（P＜0.05）。结论:1.大鼠坐骨神经结扎后,脊髓背角caspase-3高表达,细胞发生凋亡,阻断caspase-3通路均可抑制凋亡,减轻痛觉过敏;非特异性阻断caspase通路均亦可抑制凋亡,减轻痛觉过敏。坐骨神经结扎引起的神经病理性疼痛可能与caspase-3通路介导的细胞凋亡有关。2.大鼠坐骨神经结扎后,脊髓背角细胞凋亡的发生可能与TNF-α表达增加,SOD下降导致ROS增多有关。抗氧化剂N-已酰半胱氨酸具有对抗大鼠神经元凋亡效应,减轻痛觉过敏。N-已酰半胱氨酸抗氧化可能将成为一种新的缓解病理性疼痛的方法。3.阻断凋亡caspase通路,抑制星形胶质细胞激活,均可抑制GAP-43的表达,同时减轻痛觉过敏。神经元凋亡时或凋亡后,芽生可能介导神经病理性疼痛的产生,星形胶质细胞的激活,IL-1的升高有助于芽生的发展。4.caspase-3的小RNA鞘内注射可在短期内减轻CCI大鼠热痛觉过敏;重组腺病毒Ad-SiCas3可持续抑制热痛觉过敏。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 主要英文缩写
• 前言
• 一、研究背景
• 二、课题总体设计
• 第一部分:坐骨神经结扎大鼠脊髓背角细胞凋亡的研究
• 材料
• 方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 第二部分:TNF-α和ROS参与CCI大鼠神经元凋亡的研究
• 材料
• 方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 第三部分:CCI大鼠脊髓背角神经元凋亡、星形胶质细胞激活促进芽生形成介导神经病理性疼痛的研究
• 材料
• 方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 第四部分:腺病毒介导的小RNA干扰caspase-3对CCI大鼠的抗伤害性刺激作用
• 材料
• 方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 全文总结:
• 综述:
• 致谢
• 附录
• 在读期间撰写及发表论文情况