论文摘要
猪传染性胃肠炎（TGE）是由猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）所致的以呕吐、严重腹泻、脱水和对7日龄以内仔猪高度致死率（通常可达100%）为特征的急性高度接触性肠道传染病。我国从第一次分离出该病毒后,在全国各地便不断有从猪场分离出该病毒的报道,其流行危害进一步加重。本病主要在冬末春初爆发,但最近儿年的调查结果显示,该病在春末夏初也有发病,而且在河南省的中小型的养猪场中发病率大约为15%～23%,给我国的养猪业造成了严重的经济损失。目前对该病的研究主要集中在诊断、治疗和疫苗的研制方向上,但实践证明收效不住。这主要是因为之前对TGEV的致病机制,特别是对TGEV惑染的分子机制了解过少造成的。而作为体内最大的抗原提呈细胞—树突状细胞（Dendritic cell, DC）,可以直接激活初始型T细胞,同时产生一系列细胞因子参与机体的免疫调节作用。DC已经被证实能够在冠状病毒感染和治疗中发挥作用,但它是否是TGEV的靶细胞,并且是否能在TGEV惑染中发挥作用,并没有被报道过。因此,本研究从猪外周血.中诱导分化出了DC,建立了体外诱导培养猪DC的体系；同时研究了TGEV对DC的感染特性和在DC内复制的能力,以及TGEV感染对DC分泌细胞因子的影响,以期揭示DC与TGEV的相互作用关系,探讨和分析TGEV的感染机制,特别是该病的分子致病机制,为有效防控TGE和提高对该病的免疫效果提供理论基础。1.采集健康猪的外周血,分离淋巴单核细胞,并用GM-CSF、IL-4和TNF-α联合诱导单核细胞向树突状细胞的分化,用倒置显微镜观察细胞的成长和分化过程,以及imDC和mDC的形态。结果显示：在rhGM-CSF、rhIL-4、rhTNF-α联合诱导培养10天后,通过倒置显微镜可以观察到细胞培养过程中的形态的变化,在诱导成熟之后具有典型的具有树突状细胞的DC形态。可以初步证实我们已成功建立了从猪外周血中体外诱导培养DC的方法,为我们下一步研究TGEV及其他病原微生物对DC的致病机制提供了新的试验思路和试验模型。2.为了解TGEV对猪DC的感染特性及其在DC中的复制能力,将TGEV体外感染成熟猪DC,于感染后1、3、12、24、48和72h收集上清及细胞。将细胞上清液感染ST细胞,通过检测细胞的病变情况,来验证细胞的毒性。提取细胞中的RNA,立即进行反转录,然后进行PCR和荧光定量RT-PCR的扩增,分析TGEV是否能感染DC,以及该病毒是否能在DC内增殖。结果显示：TGEV感染DC后1h就能检测到病毒,而且随着感染时间的延长,DC中的TGEV含量逐渐增加,表明TGEV能够成功感染DC,且能在DC内复制和增殖。3.为了解TGEV感染对DC分泌细胞因子的影响,采用双抗夹心ELISA法检测TGEV、惑染猪DC后1、3、12、24、48和72h的细胞上清液中的IL-6、IL-10、TNF-α、IFN-α和IFN-γ的含量：用Real-time PCR技术检测TGEV感染mDC后不同时间的免疫相关因子（IL-6、IL-8、IL-12p35、IL-12p40、IL-17、IL-18）在mRNA转录水平的变化。结果显示,TGEV感染DC后引起IL-6、IL-10、IFN-α在蛋白水平表达量上调,其中以IFN-α的上调尤为显著;TNF-α的含量有所下降,IFN-γ的含量没有明显的变化。在细胞中IL-12 p35的表达在24 h达到高峰IL-12p40、IL-6和IL-18的表达上升,其中IL-12p40在感染后72h达到高峰,而IL-6和IL-18在48h达到高峰;IL-8在病毒感染后其表达量逐渐降低,直至72h达到最低点；IL-17的表达量在感染病毒前后变化不大,以上数据表明TGEV感染DC后引起了相关细胞因子表达的变化,该试验的结果为进一步研究TGEV与DC的相互作用关系奠定r基础。
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标签：猪传染性胃肠炎病毒论文; 树突状细胞论文; 细胞因子论文; 荧光定量论文;