Rho激酶在乳鼠心肌细胞模拟缺血再灌注损伤细胞凋亡中的作用

论文摘要

目的缺血再灌注损伤（ischemia reperfusloin injury,I/R）是指细胞因缺血发生可逆性损伤,在缺血纠正后这种损伤反而加重并引起细胞凋亡或进一步功能障碍。近年实验和临床研究发现,细胞凋亡是心肌缺血再灌注损伤发生机制中的重要环节之一,是心肌受损,心力衰竭发生、发展的重要因素。当前,心肌细胞凋亡是心肌缺血再灌注损伤方面研究的崭新课题,探讨心肌缺血再灌注损伤导致细胞凋亡的作用机制并对其有效干预,对心肌缺血再灌注损伤的防治有重要意义。本文拟将乳鼠心肌细胞进行分离、纯化,建立心肌细胞缺血再灌注损伤模型,观察Rho激酶在培养乳鼠心肌细胞缺血再灌注损伤细胞凋亡中的作用,及Rho激酶抑制剂盐酸法舒地尔（fasudil）对缺血再灌注损伤细胞凋亡的影响。方法采用体外心肌细胞培养技术,原代培养出生1～2d的SD乳鼠心肌细胞,倒置相差显微镜下动态观察心肌细胞形态学变化。应用肌钙蛋白抗体免疫荧光标记培养的心肌细胞,激光共聚焦显微镜观察鉴定心肌细胞纯度。用自制简易缺氧装置建立培养心肌细胞缺血再灌注损伤实验模型。实验分3组:①对照组②I/R组③I/R+F组:建立I/R模型前20min加入法舒地尔,使其终浓度分别为10μmol/L（F1组）,30μmol/L（F2组）,50μmol/L（F3组）。Western blot分别检测缺血2h,再灌注3h后肌球蛋白磷酸酶目标亚单位1（myosin phosphatase targetsubunit 1,MYPT1）磷酸化水平,作为Rho激酶功能活化的标志。应用流式细胞仪Annexin-V/PI双色法检测再灌注3h,6h时间点心肌细胞的凋亡率。结果1.心肌细胞形态学观察:倒置相差显微镜下可见原代组织块和单个心肌细胞在接种12～24h后开始贴壁生长,初为圆形,后为梭形或不规则三角形。细胞伸出的伪足相互接触交织成网,3～5d后逐渐连接成片,形成致密单层。单个细胞有自发性蠕动,可见成簇细胞呈岛屿状的自发性搏动,频率约为80～100次/min。细胞质有突起、分叉,多数为单个细胞核,部分为双核,有1～2个核仁。2.培养心肌细胞的鉴定:激光共聚焦显微镜下观察细胞爬片,可见细胞浆中均匀绿色荧光染色,细胞核不着色,细胞染色阳性率达90%以上。3.Rho激酶蛋白表达检测:再灌注3h后MYPT1的磷酸化水平明显增加,I/R组Rho激酶蛋白相对表达量为对照组的5.7倍（P＜0.01）;10μmol/L（F1）、30μmol/L（F2）、50μmol/L（F3）法舒地尔干预后,Rho激酶蛋白相对表达量较I/R组分别降低24.6%、40.1%、60.1%,差异具有统计学意义（P＜0.05）。4.细胞凋亡率检测:I/R组与对照组相比,心肌细胞的凋亡率明显升高;药物干预组随着药物浓度的增高,细胞凋亡率呈下降趋势,与I/R组比较差异具有统计学意义（P＜0.05）,各药物浓度组间差异均具有统计学意义（P＜0.05）。随着再灌注时间的延长,6h缺血再灌注组和药物干预组的细胞凋亡率明显高于相对应的3h各组（P＜0.05）。结论1.Rho激酶在缺血再灌注损伤心肌细胞中有促凋亡作用。2.法舒地尔可以减少缺血再灌注心肌细胞凋亡的发生,从而发挥良好的心肌保护作用。

论文目录

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