耐盐相关基因mangrin和ZRP4的克隆、分析与功能研究

论文摘要

世界上存在着大面积的盐碱地,高浓度的盐胁迫造成植物生长停滞,甚至导致死亡。盐碱耕地中种植的作物往往发生大幅的减产,目前解决这个问题的方法之一就是培育出优良的耐逆作物。应用分子生物学、分子遗传学等方法研究作物抗逆机制,寻找抗逆基因,并通过基因工程手段培育抗逆作物品种已成为现代农业研究的重要内容。本研究在总结当前植物对逆境胁迫应答的生理、生化及分子生物学进展的基础上,以水稻和红树植物海莲为主要研究材料,开展了植物抗逆机制和相关基因工程研究,得到如下结果:1.运用RT-PCR方法,从水稻中克隆了耐盐相关基因ZRP4,该基因全长1101 bp,编码了366个氨基酸组成的蛋白质,该蛋白质是由O-甲基转移酶调控。盐胁迫下,植物调节甲基转移酶的活性,能够高效地修复胁迫引起的蛋白质损伤,提高植物的抗逆能力。本研究构建了ZRP4基因的植物表达载体和ZRP4基因的RNAi表达载体,并通过农杆菌介导法将两个载体分别导入水稻,获得转ZRP4基因水稻和ZRP4基因RNAi转基因水稻。转基因植株T0代和T1代耐盐性检测表明,超量表达ZRP4基因水稻的耐盐能力得到了较大的提高,在150 mmol/L NaCl胁迫20 d后,成活率为60%,而未转化植株全部死亡;而ZRP4基因RNAi转基因水稻有效地抑制了甲基转移酶的活性,阻断甲基转移酶修复胁迫引起的蛋白质损伤,降低了水稻的耐盐能力,使其对盐胁迫显著敏感,100 mmol/L NaCl胁迫20 d后,成活率为60%,明显低于未转化植株的90%成活率。2.运用PCR方法,从红树林植物海莲中克隆了耐盐相关基因mangrin,该基因全长为771bp,编码一个256个氨基酸残基组成的蛋白质,这个蛋白质为丙二烯氧化物环氧化酶（allene oxide cyclase,AOC）的同系物。mangrin基因的耐盐特性可能与其蛋白中有一个从16位至86位的70个氨基酸功能区域有关,该功能区具有一个与LEA蛋白中相似的富含丝氨酸区域,这个富含丝氨酸区域在胁迫时起到保护蛋白质和膜结构的作用。本研究将构建的mangrin基因植物表达载体,通过农杆菌介导法转入水稻,获得转mangrin基因水稻。转基因植株T0代和T1代耐盐性检测表明,超量表达mangrin基因水稻的耐盐能力得到了很大的提高,200 mmol/L NaCl胁迫20 d后,成活率为80%,而未转化植株、转ZRP4基因植株和ZRP4基因RNAi转基因植株皆死亡。3.转基因植株生理生化分析表明,在盐胁迫下,转耐盐相关基因mangrin和ZRP4基因植株在相对含水量、细胞质膜透性、SOD、CAT和POD酶活性、脯氨酸含量、MDA

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 文献综述
• 1.1 盐分对植物的伤害
• 1.2 植物耐盐机制
• 1.2.1 渗透调节机制
• 1.2.2 离子区隔化作用
• 1.2.3 吸钾排钠机制
• 1.2.4 抗氧化防御机制
• 1.2.5 盐胁迫蛋白
• 1.2.6 改变植物的光合作用途径
• 1.3 植物耐盐基因工程
• 1.3.1 BADH 基因（甜菜碱醛脱氢酶基因）
• 1.3.2 mtlD 和gutD（1-磷酸甘露醇脱氢酶和6-磷酸山梨醇脱氢酶）基因
• 1.3.3 吡咯啉-5-羧酸合成酶基因（P5CS）
• 1.3.4 LEA（胚胎发生晚期丰富蛋白基因）
• 1.3.5 Osmotin 合成酶基因（渗调蛋白合成酶基因）
• 1.4 两种与耐盐相关的基因
• 1.4.1 甲基转移酶基因
• 1.4.2 丙二烯环氧化酶基因
• 1.5 水稻遗传转化研究
• 1.5.1 水稻遗传转化方法的研究
• 1.5.2 根癌农杆菌介导的水稻遗传转化
• 1.5.3 水稻耐盐的遗传分析
• 1.5.4 水稻耐盐性鉴定方法和指标
• 1.6 RNA 干扰技术（RNA interference, RNAi）
• 1.6.1 RNA 干扰研究的历史
• 1.6.2 RNAi 的作用机制
• 1.6.3 植物中的 RNAi 研究
• 1.7 选题背景、目的和意义
• 第二章 水稻ZRP4 基因的克隆与分析
• 2.1 材料
• 2.1.1 植物材料
• 2.1.2 菌株和质粒
• 2.1.3 试剂
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 ZRP4 基因的克隆
• 2.2.2 ZRP4 基因植物表达载体的构建
• 2.2.3 ZRP4 基因RANi 表达载体的构建
• 2.2.4 农杆菌的转化
• 2.3 结果与分析
• 2.3.1 ZRP4 的克隆
• 2.3.2 ZRP4 植物表达载体的鉴定
• 2.3.3 ZRP4 基因RNAi 表达载体的构建
• 2.3.4 载体转化农杆菌的鉴定
• 2.4 讨论
• 第三章 红树林耐盐相关基因mangrin 的克隆和植物表达载体的构建
• 3.1 材料
• 3.1.1 植物材料
• 3.1.2 菌株和质粒
• 3.1.3 试剂
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 海莲DNA 的提取
• 3.2.2 mangrin 基因的DNA 全长的合成
• 3.2.3 mangrin基因植物表达载体的构建
• 3.2.4 农杆菌的转化和鉴定
• 3.3 结果与分析
• 3.3.1 mangrin基因全长的获得
• 3.3.2 mangrin 植物表达载体的鉴定
• 3.3.3 农杆菌鉴定
• 3.4 讨论
• 第四章 水稻的遗传转化及耐盐性的鉴定
• 4.1 材料
• 4.2 实验方法
• 4.2.1 水稻幼胚的组织培养
• 4.2.2 农杆菌介导的遗传体系
• 0 代分子生物学检测'>4.2.3 转基因植株 T₀代分子生物学检测
• 0 代的耐盐性检测'>4.2.4 转基因植株 T₀代的耐盐性检测
• 1 代的遗传性分析及分子生物学检测'>4.2.5 转基因植株 T₁代的遗传性分析及分子生物学检测
• 0 代种子的耐盐性检测'>4.2.6 转基因植株 T₀代种子的耐盐性检测
• 4.3 结果与分析
• 4.3.1 转基因植株的获得
• 4.3.2 转基因植株的分子生物学检测
• 4.3.3 转基因植株耐盐性鉴定
• 1 代的遗传性分析及分子生物学检测结果'>4.3.4 转基因植株 T₁代的遗传性分析及分子生物学检测结果
• 0 代种子的耐盐性检测'>4.3.5 转基因植株 T₀代种子的耐盐性检测
• 4.4 讨论
• 4.4.1 根癌农杆菌介导法各参数的优化
• 4.4.2 RNAi 技术在植物功能基因鉴定中的应用
• 4.4.3 水稻 O-甲基转移酶 ZRP4 基因的功能分析
• 4.4.4 红树耐盐相关基因mangrin 基因的功能分析
• 结论
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 作者简介