论文摘要
脊髓小脑型共济失调Ⅲ型/马查多-约瑟夫病（SCA3/MJD）,是一种以神经细胞变性、细胞核内蛋白聚集体形成为病理特征的常染色体显性遗传病。其致病基因编码区含一段异常扩展的CAG三核苷酸重复序,基因编码产物ataxin-3相应含一段异常扩展的多聚谷氨酰胺（polyglutamine, polyQ）肽链。目前包括SCA3/MJD在内的所有polyQ疾病的发病机制尚不完全清楚,但扩展突变的polyQ蛋白尤其是含polyQ链的短降解片段获得毒性是导致polyQ疾病发生的最基本原因这点已经取得了大家的共识。研究表明自吞噬参与了降解ataxin-3等polyQ蛋白,药物诱导自吞噬能明显缓解扩展突变型polyQ蛋白的细胞毒性。近年研究证实ataxin-3存在多个磷酸化位点,磷酸化修饰ataxin-3参与调控其降解速度、细胞内定位以及形成蛋白聚合体趋势等,但关于ataxin-3的磷酸化修饰是否参与调节其被自吞噬降解的效率以及调节其毒性片段的产生还没有研究报道,本实验将从这方面探讨磷酸化修饰与自吞噬的关系。我们拟构建ataxin-3的磷酸化位点缺失突变体（丝氨酸→丙氨酸/S→A）以及拟磷酸化突变体（丝氨酸→天冬氨酸/S→D）的真核表达质粒,通过转染细胞,用Western blotting检测蛋白表达水平,以探讨磷酸化修饰对ataxin-3在细胞内经自吞噬降解的影响。目的：探讨磷酸化修饰ataxin-3对其通过自吞噬降解的影响。方法：1构建ataxin-3的磷酸化位点缺失和拟磷酸化突变体的真核表达质粒。2用自吞噬抑制剂3-MA处理转染细胞,运用Western blotting检测各组细胞ataxin-3的表达。3用自吞噬激活剂Rapamycin处理转染细胞,运用Western blotting检测各组细胞ataxin-3的表达。结果：1、经3-MA抑制自吞噬处理细胞后,无论野生型还是polyQ扩展突变型ataxin-3表达均增加；经Rapamycin诱导自吞噬处理细胞后,野生型和扩展突变型ataxin-3表达均明显减少。2、经3-MA抑制自吞噬处理的各组细胞均明显产生一条短的ataxin-3降解片段。ataxin-3磷酸化修饰对短片段产生无明显影响。3、S260D突变后,可以促进ataxin-3蛋白的降解,与Rapamycin有协同作用；而S260A突变后,对ataxin-3蛋白的降解无明显影响。结论：1、成功构建了ataxin-3磷酸化位点的模拟磷酸化和磷酸化缺失突变体真核表达质粒；2、自吞噬途径参与了细胞内ataxin-3蛋白的降解；3、自吞噬经Rapamycin诱导增强后,260位丝氨酸磷酸化促进自吞噬降解ataxin-3蛋白；4、自吞噬可能参与了调节ataxin-3毒性片段的产生