利用农杆菌介导法将pta和sb401基因导入甘蓝型油菜的研究

论文摘要

油菜是一种适应性强、用途广、经济价值高、发展潜力大的油料作物,我国60%以上的人口食用菜油,我国油菜面积和总产居世界首位,然而其单产和品质却远远低于加拿大及其他欧洲国家。在油菜生产中,病虫害的发生是油菜高产稳产的限制因子之一。另外,在我国由于常规油菜芥酸和硫代葡萄糖甙含量较高,严重影响了菜籽油的品质和菜籽饼粕的开发应用。因此,推广和普及双低油菜品种、改良品种的抗病虫性并提高菜籽蛋白营养品质,对我国油菜产业的发展将具有重要的意义。基因工程技术的发展,打破了传统育种的局限,可以同时将含目标性状的一个或多个基因导入受体作物基因组,达到对农作物一个或多个性状的改良。从而为作物育种和改良开拓了一条崭新的途径。由于农杆菌介导的植物转基因方法具有操作简单、转化效率高、较少的拷贝数及整合机制相对简单等优点,而被植物转基因工作者广泛推崇。但农杆菌转化法是一个细菌和愈伤组织共同作用的复杂过程。凡是涉及到细菌活性或愈伤组织状态的因素都可能影响其转化效果。迄今为止,油菜农杆菌转化系统仍存在不少问题,国内外的油菜转基因报道中多以某一特定品种为转化受体,其结果不具有普遍性。本研究利用农杆菌介导法将构建于同一表达载体的抗油菜蚜虫等同翅目害虫的半夏凝集素pta基因和富含赖氨酸的马铃薯花粉特异水溶性蛋白基因sb401转入甘蓝型双低油菜中,主要成果如下: 1.选择四川目前推广的中双6号等8个甘蓝型双低常规油菜品种作为农杆菌转化受体材料,设置了8种激素配比组合,通过选择基本培养基、无菌苗的苗龄、下胚轴切段长度等因素探讨其对植株再生的影响,确定了以MS+6-BA1mg/L+2.4-D0.5mg/L培养基作为下胚轴分化的预培养基,以MS+1～4mg/L 6-BA+0.05～0.4mg/LNAA为分化培养基,初步建立了不同油菜品种下胚轴的高效再生体系。应用该再生系统,中双6号等四个品种的分化率可达40.67～69.67%。 2.在建立高效再生系统的基础上,进一步建立了油菜下胚轴的遗传转化系统。结果表明,取5～6d无菌苗下胚轴,切成0.5cm小段,在附加1.0mg/L 6-BA和0.5mg/L 2.4-D的MS培养基上对下胚轴进行2d的预培养;在OD600=0.3时离心收集农杆菌菌体并用MS液等体积重悬后,将下胚轴放入悬浮液中浸染30～60S,取出吸去多余菌液后于共培养基（附加100μm/L乙酰丁香酮的预培养基）上进行30～42h的与农杆菌共培养;用cb200mg/L+cef400mg/L洗菌,洗菌后的下胚轴进行一定的干燥处理,并在6—BA 1～4mg/L和NAA 0.05～0.4mg/L配比组合的分化培养基上进行6～7d的脱菌培养;再进行筛选分化培养;对抗性芽根据不同品种选择适合的生根培养基进行生根培养。实验证明该再生转化系统选材方便,转化相对简单,各单因素的作用效果明显。 3.应用上述遗传转化体系,将构建在同一载体（pDB13PS）T-DNA上的pta和sb401基因

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Ⅰ 文献综述

1 植物基因转化的主要技术路线

1.1 目的基因的制备和克隆

1.2 克隆载体的构建及向感受态细胞导入

1.2.1 粘性末端连接

1.2.2 平末端连接

1.2.3 同聚物加尾连接

1.2.4 人工接头连接

1.3 重组体的筛选和鉴定

1.4 植物工程载体的构建与筛选

1.5 植物基因转化受体系统和介导系统的建立

1.6 转化后植物组织的筛选、再生、培育

1.7 外源目的基因整合的鉴定

1.8 外源基因表达的检测

1.9 转基因植物表型、代谢及生物学鉴定

1.10 转基因植物遗传稳定性分析、环境生态效应分析

2 目前油菜转基因的主要方法

3 几种常用植物基因转化方法比较

3.1 农杆菌介导转化法

i质粒介导遗传转化的原理'>3.1.1 根癌农杆菌T_i质粒介导遗传转化的原理

3.1.2 农杆菌介导的遗传转化系统在油菜育种中的应用及进展

3.2 PEG法

3.3 电击法

3.4 基因枪法

3.5 花粉管通道法

3.6 注射法

3.6.1 显微注射法

3.6.2 直接注射法

3.7 脂质体介导法

4 油菜基因转化中常用的筛选标记基因和报告基因

4.1 选择标记基因

4.2 报告基因

5 油菜转基因的遗传特性

5.1 外源基因的表达调控

5.1.1 组成型启动子

5.1.2 器官特异性表达启动子

5.1.3 损伤诱导型启动子

5.2 外源基因沉默

5.3 外源基因的遗传特性及传递规律

6 油菜转基因育种的应用

6.1 油菜抗虫基因工程育种

6.2 油菜抗病基因工程育种

6.3 抗除草剂育种

6.4 油菜作为生物反应器

7 半夏凝集素（PTA）等植物凝集素的抗性机理

8 菜籽油（饼）的开发利用

9 本研究的立题设想

Ⅱ 材料与方法

1 实验材料

1.1 受体材料

1.2 菌株、质粒和基因

1.3 培养基

1.3.1 用于细菌培养的YEB培养基和下胚轴培养的MS基本培养基的配置

1.3.2 用于下胚轴再生的培养基

1.3.3 用于下胚轴农杆菌转化的几种培养基

1.4 酶、PCR引物和药品

1.4.1 酶和引物

1.4.2 主要药品试剂

1.5 主要实验仪器

1.6 重要实验溶液

1.6.1 植物基因组DNA提取液

1.6.2 质粒DNA提取液

1.6.3 电泳溶液

1.6.4 Southern blotting溶液（1L）

2 实验方法

2.1 下胚轴的再生

2.1.1 无菌苗获得

2.1.2 下胚轴的再生

2.2 农杆菌的转化

2.2.1 农杆菌的培养

2.2.2 潮霉素敏感性试验

2.2.3 下胚轴预培养

2.2.4 下胚轴与农杆菌共培养

2.2.5 下胚轴脱菌培养对遗传转化的影响

2.2.6 筛选分化及生根

2.3 转基因植株的移栽及大田管理

2.4 转基因植株的分子检测

2.4.1 转基因植株PCR检测

2.4.1.1 用于PCR检测的转基因植株微量DNA提取

2.4.1.2 PCR反应扩增体系溶液

2.4.1.3 PCR引物序列、反应条件及目的片段大小

2.4.1.4 PCR扩增产物的检测—琼脂糖凝胶电泳

2.4.2 转基因植株Southern blot检测

Ⅲ 结果分析

1 油菜下胚轴再生体系的优化

2 农杆菌转化体系的优化

2.1 潮霉素敏感性试验结果

2.2 预培养对转化的影响

2.3 农杆菌浓度、重悬及侵染时间对转化的影响

2.4 转化后共培养时间的确定

2.5 不同抗生素的脱菌效果及对下胚轴生长的影响

3、GA₃对芽苗分化的影响'>2.6 AgNO₃、GA₃对芽苗分化的影响

2.7 生根培养基的筛选

3 炼苗移栽

4 转基因Hyg抗性植株的获得及分子检测

4.1 转基因植株PCR检测

4.2 Southern blotting分析

4.3 转基因植株田间表现

Ⅳ 讨论

1 下胚轴可再生细胞部位的探索

2 AgNO3的作用机理

3 下胚轴分化再生率和转化率的相关性

4 外源基因的表达

Ⅴ 本实验的后续设想

参考文献

缩略词表

论文成果

致谢

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