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盐胁迫下中度嗜盐菌Bacillus sp. I121质膜蛋白质组学研究

2020-12-01阅读(613)

盐胁迫下中度嗜盐菌Bacillus sp. I121质膜蛋白质组学研究

论文摘要

以中度嗜盐Bacillus.sp I121为材料,通过蛋白质组学的方法研究了Bacillus.spI121的质膜蛋白组在盐胁迫下的变化情况以及相关的膜蛋白质在细菌渗透调节中发挥的作用。主要研究内容如下:一、中度嗜盐菌Bacillus.sp I121的生理研究对Bacillus.sp I121的耐盐性研究发现,Bacillus.sp I121在NaCl浓度为0.2M-3.6M的范围下均可以生长。Bacillus.sp I121的最适NaCl生长浓度为0.9M。当盐浓度达到3.6M时,Bacillus.sp I121的生长受到了严重的抑制。在不同的NaCl生长浓度下对Bacillus.sp I121胞内积累的相容性溶质进行了测定。测定结果表明,Bacillus.sp I121胞内基本不积累海藻糖和甜菜碱。在较低的盐浓度下,Bacillus.sp I121主要积累脯氨酸来抵抗外界盐胁迫,在较高的浓度下则主要积累四氢嘧啶。通过外源添加的方法研究了Bacillus.sp I121对不同碳源物质的利用情况。研究结果表明,Bacillus.sp I121能较好地利用麦芽糖和蔗糖等双糖,并且能迅速利用谷氨酸,而对葡萄糖、果糖等单糖的利用效果较差。研究了外源添加相容性溶质对Bacillus.sp I121生长的刺激作用。研究发现,谷氨酸能显著刺激Bacillus.sp I121的生长,而脯氨酸和四氢嘧啶对Bacillus.sp I121的生长没有刺激作用。实验结果表明脯氨酸和四氢嘧啶主要靠体内合成的途径来积累,细胞膜上可能存在负责运输谷氨酸的转运蛋白。二、中度嗜盐菌Bacillus.sp I121的差异质膜蛋白质组学研究利用5%-20%SDS-PAGE梯度胶分离研究了不同盐浓度下Bacillus.sp I121的质膜蛋白质变化情况,研究结果发现8个蛋白条带染色强度在不同的盐浓度下发生了较大的变化。对这些蛋白条带分别进行了质谱鉴定,鉴定出的蛋白质绝大多数为跨膜蛋白。结果表明SDS-PAGE适于分离疏水性较强的膜蛋白,然而由于分辨率较低,条带中的蛋白质种类较多,因此不适合进行不同生长条件下的比较研究。用双向蓝色温和电泳BN/SDS-PAGE的方法研究了不同盐浓度下生长的Bacillus.spI121的质膜蛋白复合体的变化情况以及这些复合体中蛋白质亚基的变化情况。BN-PAGE的单向电泳结果表明,在不同的盐浓度下至少分离到了10个蛋白条带,这些条带分布在20KDa到1000KDa的范围内,并且这些条带在表达量上有较大变化,表明质膜蛋白复合物对盐胁迫存在显著和广泛的响应。通过用BN/SDS-PAGE的方法进行第二向分离,发现了9个蛋白质点的表达在盐胁迫前后存在显著差异。我们对这些变化的蛋白质点进行了质谱鉴定,成功鉴定了8种蛋白。其中表达上调的点有:ABC transporter permease,glycerol-3-phosphate permease,pyrimidine nucleotide transporter,formate dehydrogenase,表达下调的点有succinatc dehydrogenase iron-sulfur subunit,F1F0-ATP synthase a和βsubunits,hypothetical protein OB1959。通过生物信息学分析并且结合测定的生理指标,结果表明:ABC transporter permease主要负责麦芽糖的运输。根据上述蛋白质组学和生理生化研究,本文提出了中度嗜盐菌Bacillus.sp I121在盐胁迫下进行渗透调节可能的分子机制:高盐胁迫诱导ABC transporter permease和glycerol-3-phosphate permease表达上调,促使更多的麦芽糖和三磷酸甘油进入细胞内,使得胞内糖代谢过程变得更加活跃;同时succinate dehydrogenase iron-sulfur subunit和ATPsynthase的下调显示三羧酸循环受到抑制,从而积累更多的中间产物用于合成脯氨酸和四氢嘧啶,这一积累过程也与核苷酸代谢密切相关。

论文目录

  • 摘要
  • ABSTRACT
  • 符号与缩略语说明
  • 第一章:文献综述
  • 一 微生物的渗透响应与耐盐机制的研究进展
  • 1 嗜盐菌的概况与分类
  • 2 中度嗜盐菌的研究历史
  • 3 微生物的渗透响应与耐盐机制
  • 3.1 细菌对盐胁迫的最初响应
  • 3.2 细菌对盐胁迫的二级响应
  • 3.3 细菌对低渗胁迫的响应
  • 3.4 相容性溶质的积累方式
  • 二 蛋白质组学的研究技术与进展
  • 1 蛋白质组学的简介
  • 2 蛋白质组学的常用技术与研究策略
  • 2.1 蛋白质的分离技术
  • 2.2 蛋白质的鉴定技术
  • 3 蛋白质组学存在的问题与发展
  • 4 差异蛋白质组学的研究与应用
  • 5 膜蛋白质组学的研究意义与概述
  • 三 盐胁迫下微生物的蛋白质组学的研究概况
  • 参考文献
  • 第二章 中度嗜盐菌Bacillus sp.I121的生理性状的研究
  • 一 材料与方法
  • 1 菌株、培养基与培养条件
  • 2 生长曲线的测定
  • 3 耐盐性分析
  • 4 相容性溶质的测定
  • 4.1 甜菜碱的测定
  • 4.2 海藻糖的测定
  • 4.3 脯氨酸的测定
  • 4.4 四氢嘧啶的测定
  • 5 相容性溶质对Bacillus sp.I121生长的刺激作用
  • 6 Bacillus.sp I121的碳源物质
  • 7 酶活测定
  • 7.1 谷氨酸脱氢酶酶活的测定
  • 7.2 谷氨酸合酶酶活的测定
  • 7.3 谷氨酰氨合酶酶活的测定
  • 二 结果与讨论
  • 1 不同盐浓度对Bacillus sp.I121生长的影响
  • 2 耐盐性分析
  • 3 相容性溶质的积累
  • 4 Bacillus sp.I121的碳源物质
  • 5 相容性溶质对Bacillus sp.I121生长的刺激作用
  • 6 酶活测定
  • 三 本章总结
  • 参考文献
  • 第三章 盐胁迫下Bacillus sp.I121差异膜蛋白质组学研究
  • 一 材料与方法
  • 1 细胞膜蛋白的SDS-PAGE分析
  • 1.1 Bacillus sp.I121的生长条件
  • 1.2 细胞破碎的方法
  • 1.3 细胞膜蛋白的抽提
  • 1.4 蛋白质样品的定量
  • 1.5 SDS-PAGE的电泳条件
  • 1.6 胶的染色和脱色
  • 2 细胞膜蛋白的BN/SDS-PAGE分析
  • 2.1 Bacillus sp.I121的生长条件
  • 2.2 细胞的破碎方法
  • 2.3 膜蛋白的抽提与样品处理
  • 2.4 膜蛋白质的定量
  • 2.5 膜蛋白质的处理
  • 2.6 Blue-Native的电泳条件
  • 2.7 BN/SDS-PAGE的双向电泳条件
  • 2.8 胶的染色
  • 3 图象的采集与分析
  • 4 质谱鉴定
  • 4.1 差异蛋白点的切取
  • 4.2 胶内酶解
  • 4.3 质谱鉴定和数据库的查询
  • 5 生物信息学分析
  • 5.1 序列比对的方法
  • 5.2 保守序列的生物信息分析
  • 二 结果与讨论
  • 1.蛋白质浓度标准曲线的绘制
  • 2.SDS-PAGE的电泳结果与图谱分析
  • 3.SDS-PAGE上差异条带的质谱鉴定结果
  • 4 Blue-Native的电泳结果
  • 5.BN/SDS-PAGE的电泳结果
  • 6.BN/SDS-PAGE上差异蛋白点的质谱鉴定结果
  • 7.目的蛋白质的序列比对与分析
  • 8.结果的分析与讨论
  • 三.本章总结
  • 参考文献
  • 全文结论
  • 创新之处
  • 致谢
  • 攻读学位论文期间发表的论文

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