地衣芽孢杆菌产抗真菌物质的分离纯化

论文摘要

从土壤中分离得到一株对多种植物病原真菌具有抑制作用的菌株,将其命名为BS-3。该菌株对水稻纹枯病、稻瘟病、苦瓜枯萎病等病原真菌均有较强抑制作用。通过对菌株BS-3的16S rDNA的序列测定和同源性比对,发现它与Bacillus licheniformis、Bacillus subtilis、Bacillus amyloliquefaciens等菌种的16S rDNA有高达100%的同源性,结合形态和生理生化指标,将其鉴定为地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）。以产抗真菌蛋白最佳培养基对地衣芽孢杆菌BS-3进行摇瓶发酵,选用受其抑制作用较明显的水稻纹枯病病原真菌瓜亡革菌（Thanatephorus cucumeris）作为指示菌,平板抑菌圈法检测BS-3发酵产物的抑菌活性。使用不同饱和度硫酸铵对BS-3菌株发酵液中的蛋白类物质进行盐析,确定最佳硫酸铵饱和度为50%。分别检测发酵上清液滤液、硫酸铵处理后离心沉淀和上清液的抑菌活性,结果表明BS-3的发酵上清液滤液、硫酸铵处理后离心沉淀对水稻纹枯病菌有较强抑菌活性。该抗菌蛋白粗提物具有较强热稳定性,对蛋白酶K和胰蛋白酶均有一定的耐受性。地衣芽孢杆菌BS-3菌株抗菌蛋白粗提物经DEAE-52阴离子交换层析后,从洗脱峰Ⅲ检测到抑菌活性,随后将该洗脱峰经Sephadex G-75凝胶层析后,得到两个峰,其中峰Ⅱ检测到了抑菌活性。该活性峰分别经SDS-PAGE和平板聚焦电泳,均显示为单一蛋白带,获知该蛋白分子量在31.0kD左右,等电点为5.41。该活性峰经C18反相HPLC柱检测,抗菌蛋白纯度达98.25%。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 绪论
• 1.1 芽孢杆菌的研究历史
• 1.2 芽孢杆菌的分类方法
• 1.2.1 经典分类（classic taxonomy）（形态特征）
• 1.2.2 数值分类（numerical taxonomy）
• 1.2.3 分子分类法（molecular taxonomy）
• 1.2.4 化学分类（chemical taxonomy）
• 1.2.5 多相分类（polyphasic taxonomy）
• 1.3 抑真菌作用的研究
• 1.3.1 芽孢杆菌抑真菌作用的研究
• 1.3.2 地衣芽孢杆菌抑真菌作用的研究
• 1.4 地衣芽孢杆菌应用于植物病害防治
• 1.4.1 抗菌物质的作用机制
• 1.4.2 国内外研究动态
• 1.5 地衣芽孢杆菌应用于饲料加工
• 1.5.1 饲料添加剂的作用机制
• 1.5.2 国内外研究动态
• 1.6 地衣芽孢杆菌应用于医药
• 1.6.1 整肠生的作用机制
• 1.6.2 整肠生的临床试验
• 1.6.3 地衣芽孢杆菌新型药剂的研究
• 1.7 地衣芽孢杆菌应用于环境污染防治
• 1.7.1 降解拟除虫菊酯类农药残留
• 1.7.2 地衣芽孢杆菌吸附重金属离子
• 1.8 本课题的研究意义与研究内容
• 1.8.1 研究目的与意义
• 1.8.2 研究内容
• 第二章 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 菌种
• 2.1.2 培养基
• 2.1.3 主要药品试剂和缓冲液
• 2.1.4 主要仪器设备
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 菌株活化
• 2.2.2 菌种鉴定
• 2.2.3 有关抑真菌的实验方法
• 2.2.4 抗菌物质的提取
• 2.2.5 抗菌物质的分离纯化
• 2.2.6 抗菌蛋白的聚丙烯酰胺凝胶电泳
• 2.2.7 蛋白质等电点测定
• 2.2.8 蛋白浓度和纯度测定
• 第三章 结果与分析
• 3.1 BS-3 菌株的鉴定
• 3.1.1 DNA 浓度和纯度
• 3.1.2 16S rDNA 序列比对
• 3.1.3 16S rDNA 系统发育分析
• 3.1.4 BS-3 菌株形态及生理生化特征
• 3.2 抗菌物质的粗提取
• 3.2.1 最佳硫酸铵饱和度的确定
• 3.2.2 抗菌蛋白的抑菌活性
• 3.2.3 抗菌蛋白的稳定性
• 3.3 抗真菌物质的分离纯化
• 3.3.1 DEAE-52 阴离子交换层析
• 3.3.2 DEAE-52 离子交换层析收集峰的抑菌活性
• 3.3.3 Sephadex G-75 分子筛凝胶层析
• 3.4 抗菌蛋白等电点测定
• 3.4.1 pH 梯度曲线制作
• 3.4.2 等电点的计算
• 3.5 抗菌蛋白纯度测定
• 3.6 抗菌蛋白含量测定
• 3.6.1 标准曲线的制作
• 3.6.2 抗菌蛋白含量测定
• 结论
• 展望
• 参考文献
• 攻读硕士学位期间取得的研究成果
• 致谢
• 附表