ACE2基因转染对糖尿病心肌病大鼠心功能的影响

论文摘要

背景随着糖尿病发病率的逐年上升,其并发的糖尿病性心肌病（diabeticcardiomyopathy,DCM）也日益受到人们的重视。越来越多证据表明,糖尿病心肌病是一个独立的、特异的心肌疾病无其他通常导致心功能减退的诱因如高血压、冠心病、瓣膜病、先天性心脏病等,也无动脉粥样硬化的证据。1974年,Hamby等首次提出了糖尿病心肌病的概念,并认为糖尿病心肌病变与糖尿病特有的代谢异常有关。其临床特征早期以心脏舒张功能不全、晚期以收缩功能不全为主,容易发生充血性心力衰竭。DCM的发病机制复杂,涉及肾素血管紧张素系统（renin-angiotensin system,RAS）激活、能量代谢紊乱、微血管微循环障碍、细胞内钙调节异常、自主神经功能紊乱等多个因素,其中心肌细胞肥大及纤维化是DCM最重要的病理改变之一,而肾素-血管紧张素系统（RAS）在这一病理改变中发挥重要作用。血管紧张素转化酶-2（Angiotensin-converting enzyme2,ACE2）是2000年发现的肾素-血管紧张素系统（RAS）新成员,与血管紧张素转化酶（Angiotensin-convertingenzyme,ACE）是同系物,两者的金属蛋白酶催化区有42%是一致的。ACE2主要分布于心脏和肾脏的血管内皮细胞、冠状动脉血管平滑肌细胞等部位。在功能上,与ACE不同,ACE2能水解血管紧张素Ⅰ（angiotensinⅠ,AngⅠ）将其转换为Ang（1-9）,并进一步在ACE或其他肽酶水解下生成Ang（1-7）;或者直接水解血管紧张素Ⅱ（angiotensinⅡ,AngⅡ）,生成Ang（1-7）,研究证实ACE2是AngⅡ水解的主要途径,而且Ang（1-7）是其主要产物。AngⅡ是目前公认的促心肌纤维化因素,可促进心肌成纤维细胞增殖和胶原合成,导致心肌纤维化,心室顺应性下降,最终致心室收缩及舒张功能不全。Ang（1-7）作为一种心血管保护性多肽,具有舒张血管、抗生长和抗增殖的作用。为此我们拟在DCM动物模型的基础上,通过基因转染使ACE2过表达,降解AngⅡ,减少胶原合成,从而改善心功能。目的1.构建DCM动物模型2.观察ACE2基因转染后心肌ACE2的表达3.研究腺病毒为载体的ACE2基因转染对大鼠糖尿病心肌病的治疗作用,并探讨其可能的机制方法72只体重为200—220g雄性Wistar大鼠,随机分为模型组（n=64只）和正常对照组（n=8只）,模型组大鼠腹腔内注射链脲佐菌素（STZ）65mg/kg,正常对照组大鼠注射等量柠檬酸钠/柠檬酸缓冲液。大鼠成糖尿病标准为:连续2次空腹血糖≥16.7mmol/L。血糖升高后,继续喂养12周,最终共60只大鼠成为糖尿病心肌病。将糖尿病心肌病大鼠随机平均分为三个组:ACE2组心肌注射携带ACE2基因的重组腺病毒100μl（1×109pfu）;EGFP组心肌注射空载重组腺病毒即增强型绿色荧光蛋白（enhanced green fluorescent protein,EGFP）100μl（1×109pfu）;DCM组心肌注射无菌生理盐水100μl。基因转染后10天,糖尿病心肌病各组随机取8只大鼠处死,实时荧光定量PCR法、免疫印迹（Western blot）检测ACE2基因的表达;基因转染前及实验末,超声心动图检测左室收缩末内径（left ventricularend systolic diameter,LVESD）、左室舒张末内径（left ventricular enddiastolic diameter,LVEDD）、射血分数（left ventricular ejection fraction,LVEF）、短轴缩短率（fractional shortening,FS）,E/A比值;实验末组织病理学检查,常规HE染色观察心肌细胞形态,Masson染色观察心肌组织胶原分布并定量分析,ELISA检测心肌AngⅡ含量;实验过程中,监测大鼠体重及空腹血糖。结果1.实验动物基本情况:实验过程中4只大鼠死亡,2只未达DCM标准予以剔除,最终共66只大鼠完成实验,其中正常对照组8只,DCM19只,EGFP组19只,ACE2组20只。2.各组动物体重及血糖测定:STZ注射后1周,与正常对照组相比,DCM大鼠体重无显著差异（P＞0.05）,空腹血糖明显升高（P＜0.01）;实验末,与正常对照组相比,其它3组大鼠体重明显下降（P＜0.01）,空腹血糖仍明显升高（P＜0.01）。3.实时荧光定量PCR检测结果:ACE2组ACE2mRNA的表达明显高于DCM组（P＜0.05）和EGFP组（P＜0.05）;DCM组与EGFP组差异无统计学意义（P＞0.05）。4.Western blot检测ACE2蛋白表达:ACE2组ACE2蛋白的表达明显高于DCM组（P＜0.01）和EGFP组（P＜0.01）;DCM组与EGFP组差异无统计学意义（P＞0.05）。5.超声心动图检测:基因转染前,与对照组相比,DCM大鼠超声心动图检测各项指标（包括LVESD、LVEDD、LVEF、FS、E/A比值）均有差异（P＜0.01）,DCM各组之间差异无统计学意义（P＞0.05）。实验末,与DCM组、EGFP组相比,ACE2组以上各指标均有好转（P＜0.05）。6.心肌组织病理学检查:HE染色切片上,正常对照组心肌细胞排列整齐,细胞核大小均一,胞浆染色均匀;DCM组、EGFP组心肌细胞排列紊乱,细胞核大小不甚规则,可见肌纤维断裂、排列紊乱;ACE2组较DCM组、EGFP组明显好转,心肌细胞排列较规整,肌纤维断裂少见,细胞核较规则。7.Masson三色染色:心肌细胞染色呈红色,间质胶原呈蓝绿色,红细胞呈橘黄色。正常对照组心肌胶原组织分布均匀;DCM组、EGFP组心肌间质胶原纤维明显增多,围绕心肌细胞的胶原纤维断裂、排列紊乱;ACE2组较DCM组心肌间质胶原纤维明显减少,相邻细胞的胶原纤维排列整齐。定量分析显示,与正常对照组相比,DCM组、EGFP组心肌组织胶原含量明显高（P＜0.01）;与DCM组和EGFP组相比,ACE2组心肌组织胶原明显降低（P＜0.01）。8.心肌AngⅡ检测:与正常对照组相比,DCM组、EGFP组心肌AngⅡ含量明显高（P＜0.01）;与DCM组相比,ACE2组心肌AngⅡ含量明显减少（P＜0.01）。结论1.通过腹腔注射STZ并喂养12个周,成功建立了糖尿病性心肌病大鼠模型,为DCM发病机制的研究提供了可靠的平台;2.基因转染后,ACE2组大鼠ACE2mRNA和蛋白表达水平明显升高。3.ACE2基因转染后,心肌AngⅡ水平下降,胶原含量减少,DCM大鼠心功能得到改善。

论文目录

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