生物材料微图形生物活性表面对细胞生长行为的调控研究

论文摘要

骨缺损及骨修复的治疗研究仍然是当今骨科领域中的一大难题，理想的骨修复替换材料应具有良好的骨传导性以及组织诱导性，通过材料表面改性是赋予材料表面良好生物相容性的重要方法之一。本文的主要目的是，通过对材料表面的生物活性分子进行精确的微图形设计从而构建微图形生物活性表面来同时改变表面的化学微环境以及建立精确的微图形拓扑结构，从而能够有效地调控成骨细胞的生长行为与功能并赋予材料良好的生物相容性。为此，本文采用微接触印刷术在生物材料（钛合金、聚苯乙烯）表面构建不同的生物活性微图形，并详细研究这些微图形生物活性表面对成骨细胞的生长行为及功能表达的影响规律。研究的主要内容和结果如下：1.对钛表面进行改性，获得醛基改性的材料表面；以牛血清白蛋白（BSA）和人纤连蛋白（FN）作为模型蛋白，采用微接触印刷术在醛基表面改性的钛表面共价固定蛋白分子从而构建不同形状及不同尺度的微图形。通过XPS、接触角、AFM等手段对每一步的材料表面进行表征，结果表明可成功在钛表面进行每一步的改性，并通过激光共聚焦在钛表面观察到了两种蛋白微图形的荧光图像。同样采用微接触印刷术，成功地在聚苯乙烯（PS）表面制备了BSA和FN蛋白微图形。通过激光共聚焦显微镜对PS表面蛋白微图形进行拍照分析，对比钛表面微图形和PS表面微图形之间稳定性，得出了材料表面共价结合制备的微图形稳定性要高于物理吸附制备的图形，而物理吸附的微图形清晰度及精确性高于共价结合制备的图形；通过分析不同尺寸微图形的激光共聚焦图片，得出微图形尺寸将会明显影响微图形印刷的精确度，当图形尺寸小于或等于5微米时，将会出现一定的变形，微图形的精确性受一定影响。并且负印章的图形相对同尺寸的正印章效果更好。2.在PS表面微图形上接种大鼠原代成骨细胞，通过显微镜观察微图形对细胞粘附、铺展、增殖的影响；同时利用免疫荧光法对细胞的骨架、核及分泌的Ⅰ型胶原蛋白和骨钙素进行染色，用激光共聚焦显微镜（CLSM）进行观察分析拍照。实验结果表明不同尺寸的微图形调控了大鼠原代成骨细胞在材料表面的粘附、铺展及增殖行为，细胞趋向于在蛋白区域粘附铺展；具有蛋白微图形的PS表面相对于普通PS表面，更能促进细胞的增殖；同时，微图形表面可诱导细胞Ⅰ型胶原蛋白和骨钙素的分泌，促进了细胞的分化。3.在自组装3-氨丙基三甲氧基硅烷（APTMS）的钛片表面接枝聚乙烯亚胺（PEI）后，接枝羧基化碳纳米管（CNT）制得CNT表面；通过接触角测量仪、X射线光电子能谱仪（XPS）、原子力显微镜（AFM）、扫描电子显微镜（SEM）等对接枝前后材料表面进行表征；在CNT材料表面接种大鼠原代成骨细胞，MTT法检测细胞存活率和增殖情况，SEM观察材料表面细胞粘附铺展情况。最后，通过微接触印刷术在APTMS改性钛片表面制备聚乙烯亚胺微图形，在PEI微图形上进一步接枝羧基化CNT制备碳纳米管微图形，SEM观察表征。分析结果表明，实验中可成功将具有羧基的单壁碳纳米管（SWCNT）接枝在钛材表面上，形成CNT表面，并能通过微接触印刷术进一步制得钛表面CNT微图形。细胞实验的结果表明，与空白钛样品表面的成骨细胞相比，表面具有CNT的样品虽然细胞存活率相对较低，但表现出更强的细胞分化能力；通过MTT，研究出活细胞的光密度随培养时间的增加而增加，表明嫁接的CNT没有明显的细胞毒性。从细胞粘附结果来看，未经修饰的钛材与CNT修饰过的钛材之间无明显差异。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 缩略词
• 1 绪论
• 1.1 问题的提出及研究意义
• 1.2 国内外研究现状
• 1.3 本论文的研究目的、研究内容及技术路线
• 1.3.1 本论文的研究目的
• 1.3.2 本论文的研究内容
• 1.3.3 本论文的技术路线
• 1.4 本论文的创新之处
• 2 材料表面改性及表面蛋白微图形的制备
• 2.1 引言
• 2.2 实验
• 2.2.1 主要材料与试剂
• 2.2.2 主要仪器与设备
• 2.2.3 微图形的设计
• 2.2.4 蛋白“墨水”的制备
• 2.2.5 钛片表面改性及微接触印刷 BSA-FITC 和 FN-TMRA
• 2.2.6 聚苯乙烯表面微接触印刷 BSA-FITC 和 FN-TMRA
• 2.2.7 钛材料表面表征
• 2.2.8. 微图形观察与表征
• 2.3. 结果与讨论
• 2.3.1. 钛材料表面的检测分析
• 2.3.2. 蛋白微图形的制备
• 2.3.3. 微图形尺寸对图形的影响
• 2.4 本章小结
• 3 材料表面 FN 微图形对细胞粘附、铺展、增殖、功能的影响
• 3.1 引言
• 3.2 实验
• 3.2.1 主要材料与试剂
• 3.2.2 主要仪器与设备
• 3.2.3 原代成骨细胞培养
• 3.2.4 原代细胞在材料表面的接种及培养
• 3.2.5 细胞的固定及其骨架染色
• 3.2.6 细胞的分泌蛋白染色
• 3.3 结果与讨论
• 3.3.1 细胞在微图形上的粘附、铺展
• 3.3.2 成骨细胞在微图形上的增殖行为
• 3.3.3 微图形表面对细胞蛋白分泌的影响
• 3.4 本章小结
• 4 钛合金表面 CNT 微图形的制备及其对细胞的影响
• 4.1 引言
• 4.2 实验
• 4.2.1 主要材料与试剂
• 4.2.2 主要仪器与设备
• 4.2.3. 将 CNT 微图形接枝在 Ti 表面
• 4.2.4. 表面接触角的测量
• 4.2.5. 表面化学元素表征
• 4.2.6. AFM
• 4.2.7 SEM
• 4.2.8 MTT 检测
• 4.2.9. 细胞粘附
• 4.3 结果与讨论
• 4.3.1. 钛表面接枝 CNT
• 4.3.2. 细胞存活率与增殖
• 4.3.3. 细胞粘附
• 4.4 本章小结
• 5 主要结论与后续工作建议
• 5.1 主要结论
• 5.2 后续研究工作的展望
• 致谢
• 参考文献
• 附录
• A 作者在攻读学位期间发表的论文目录
• B 作者在攻读学位期间参加的科研项目情况