青杄HAP5和FKBP12的原核表达及多克隆抗体的制备

论文摘要

青杆作为我国的特有树种,耐阴抗寒,适应力强,分布广泛,是一种比较有代表性的裸子植物。HAP是与CCAAT框结合的非常重要的一类转录因子,控制基因的表达,并广泛分布于酵母、哺乳动物、植物细胞中。HAP复合体包括三种不同的亚基,HAP5是其中一种,对于植物响应干旱胁迫有着非常重要的意义。FKBPs是一个高度同源的伴侣分子蛋白家族,可以和免疫以抑制剂结合从而起到免疫抑制作用。植物FKBP12基因在逆境胁迫作用下可能起到调控作用。本研究要制备HAP5和FKBP12的多克隆抗体,为进一步分析HAP5和FKBP12的蛋白定位、表达等提供基础,并以青杆花粉为试材,研究两个基因在青杆花粉中的定位。提取青杆花粉的RNA,以RNA为模板反转录cDNA,设计两个基因的引物,采用PCR方法扩增FKBP12和HAP5基因,得到两个基因的全长cDNA序列,并将其克隆至原核表达载体pET-48b中,转入BL21菌株。经IPTG诱导,表达了分子量约为33kD和45kD的重组蛋白,SDS-PAGE和Western blotting检测鉴定表达产物。表达的蛋白经亲和纯化后,作为抗原注射新西兰兔体内,进行抗体制备,并以制得的多克隆抗体为一抗,通过抗原抗体间的免疫反应,进行两个基因的间接免疫荧光定位。1、经琼脂糖凝胶电泳检测目的条带验证,成功的获得了FKBP12和HAP5基因的全长cDNA序列。2、菌落PCR和测序可证明,FKBP12和HAP5的原核表达载体构建成功,为蛋白的大量表达奠定了基础。3、通过亲和层析,获得了较高纯度的目的蛋白,可以以此为抗原免疫动物制备多克隆抗体。4、本研究成功获取了多克隆抗体,制备的FKBP12和HAP5兔抗血清效价都在1：729000以上,ELISA结果表明融合蛋白具良好的免疫原性。间接ELISA法检测纯化后抗体效价,表明纯化后抗FKBP12和抗HAP5蛋白兔多克隆抗体效价都很高,检测灵敏度都达到16ng/mL。所制备的抗体能满足后续试验要求的效价值,为进一步研究提供基础。5、用FKBP12和HAP5多克隆抗体和FITC二抗处理萌发的花粉,进行免疫荧光实验,证实了FKBP12和HAP5在花粉管中的表达情况。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 目录
• 1 绪论
• 1.1 转录因子
• 1.1.1 植物转录因子概述
• 1.1.2 植物转录因子的结构
• 1.1.3 植物转录因子的分类
• 1.1.4 植物转录因子的功能
• 1.1.5 HAP类转录因了的发现过程
• 1.1.6 CCAT-box结构
• 1.1.7 HAP类转录因子命名
• 1.1.8 HAP类转录因子成员
• 1.1.9 HAP转录因子和DNA的特异性结合
• 1.1.10 植物中的HAP转录因子
• 1.1.11 HAP转录因子的研究进展及展望
• 1.2 亲免素
• 1.2.1 FKBP12的结构及功能
• 1.2.2 植物中的FKBP12
• 1.3 本研究的目的与意义
• 2. 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 植物材料
• 2.1.2 植物材料的培养与处理
• 2.1.3 载体与菌株
• 2.1.4 实验动物
• 2.1.5 主要试剂
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 HAP5和FKBP12基因的克隆
• 2.2.2 原核表达载体的构建
• 2.2.3 融合蛋白小量诱导表达及检测
• 2.2.4 融合蛋白的诱导表达及可溶性分析
• 2.2.5 融合蛋白的纯化
• 2.2.6 抗体的制备及效价的检测
• 2.2.7 ProteinA纯化抗血清
• 2.2.8 间接ELISA法检测纯化后抗体效价
• 2.2.9 抗体的Western blotting检测
• 2.2.10 花粉萌发实验
• 2.2.11 花粉总蛋白的提取
• 2.2.12 间接免疫荧光显微镜定位
• 3 结果分析
• 3.1 基因全长的扩增
• 3.2 重组表达载体的鉴定
• 3.3 融合蛋白的可溶性分析
• 3.4 融合蛋白表达量的分析
• 3.5 融合蛋白的亲和层析纯化
• 3.6 本底反应
• 3.7 多克隆抗体的间接ELISA检测
• 3.8 ProteinA纯化后抗血清的检测
• 3.9 免疫印记检测抗体特性
• 3.10 花粉萌发时间的探索
• 3.11 间接免疫荧光定位
• 4 讨论
• 4.1 融合蛋白表达条件的分析
• 4.2 蛋白表达量的问题
• 4.3 融合蛋白的纯化方法
• 4.4 抗原的制备
• 4.5 间接免疫荧光定位的分析
• 5 结论
• 参考文献
• 个人简介
• 第一导师简介
• 第二导师简介
• 致谢