人补体调节蛋白基因的克隆、共表达及功能研究

论文题目: 人补体调节蛋白基因的克隆、共表达及功能研究

论文类型: 博士论文

论文专业: 微生物学

作者: 徐莉

导师: 李文鑫

关键词: 超急性排斥反应,补体调节蛋白,同种限制作用,衰变加速因子,膜辅蛋白,终末阶段同源限制因子,内启动子,内核糖体进入位点序列,共表达,协同作用

文献来源: 武汉大学

发表年度: 2005

论文摘要: 异种器官移植成为解决器官短缺的有效途径正受到越来越多的关注。然而免疫排斥反应,特别是超急性排斥反应(hyperacute rejection,HAR)很大程度上制约了它的发展。补体系统激活是异种器官移植超急性排斥反应发生的主要原因,抑制受体的补体系统就可以阻止超急性排斥反应的发生。膜补体调节蛋白衰变加速因子(decay accelerating factor,DAF),膜辅蛋白(membrane cofactor protein,MCP)和保护素(protectin,CD59)是补体系统中具有明显的同种限制作用的3种补体下调因子,在补体攻击时能提供区分“自我”与“非我”的方式,保护宿主细胞不受同源性补体的伤害,从而延长移植物的存活时间,克服超急性排斥反应的发生,在异种器官移植方面有重大的应用价值。因此人补体调节蛋白(complement regulator proteins,CRPs)是目前异种移植界的研究热点之一。 本研究根据文献报道的衰变加速因子DAF cDNA的序列,设计并合成特异引物,以中国人胚胎mRNA为模板,采用RT-PCR方法扩增出1684 bpDAF cDNA。序列分析表明,该cDNA含DAF全长编码区,共编码381个氨基酸,没有编码Alu家族的序列,为GPI锚连型DAF。 将DAF全长cDNA序列插入真核表达载体pcDNA3,成功地构建了重组真核表达载体pcDNA3-DAF,以磷酸钙沉淀法转染NIH/3T3细胞,用G418筛选获得NIH/3T3DAF,PCR实验结果显示DAF基因整合在转化的NIH/3T3细胞的染色体上,RT-PCR和Western印迹实验分别从RNA水平和蛋白质水平证实了人补体调节蛋白DAF在NIH/3T3DAF细胞系中获得表达。检测连续传代30次NIH/3T3DAF结果表明人补体调节蛋白基因DAF仍稳定整合并高效表达,并未随着传代而丢失,以上结果显

论文目录:

中文摘要

英文摘要

第一章 异种器管移植的研究进展

1.1 异种器官移植的概况

1.2 异种器官移植的主要障碍：超急性排斥反应

1.2.1 内皮细胞是一个功能复杂的效应器

1.2.2 自然抗体可以识别异种抗原而激活补体

1.2.3 异种抗原的去除可以避免或减轻超急性排斥反应

1.2.4 补体在超急性排斥反应中起关键性作用

1.3 克服超急性排斥反应的主要策略

1.3.1 培育表达人源补体调节蛋白的转基因动物

1.3.2 利用基因工程技术产生α1，3GT缺陷的转基因动物

1.3.3 异种器官移植研究问题与展望

1.4 本论文研究背景及目标

第二章 人衰变加速因子DAF的cDNA克隆及序列分析

0 引言

1 材料和方法

1.1 材料与试剂

1.2 引物的设计与合成

1.3方法

2 结果和讨论(Results and Discussion)

2.1 胚胎组织总RNA的提取

2.2 mRNA的分离及定量

2.3 cDNA第一链的合成以及DAFcDNA的扩增

2.4 PCR产物的纯化回收及与T-载体的连接、转化

2.5 DAF cDNA重组子的PCR鉴定

2.6 DAF cDNA的核苷酸序列及翻译蛋白质序列的特征分析

2.7 DAF基因的序列和结构分析

第三章 人衰变加速因子DAF的真核表达及功能研究

0 引言

1 材料和方法

1.1 材料与试剂

1.2 方法

2 实验结果与讨论

2.1 重组真核表达载体pcDNA3-DAF的构建及鉴定

2.2 G418最适作用浓度的选择

2.3 稳定细胞系pcDNA3-DAF NIH／3T3的建立

2.4 NIH／3T3 pcDNA3和NIH／3T3 pcDNA3-DAF两种转化细胞的特性

2.5 稳定表达的人DAF分子保护NIH／3T3细胞免受人补体溶破作用

第四章 人补体调节蛋白MCP、CD59在NIH／3T3细胞中的共表达及功能研究

0 引言

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.2 实验方法

2 实验结果

2.1 pcDNA3-MCPCD59-DP和pcDNA3-MCPIRESCD59重组真核表达载体的构建及鉴定

2.2 NIH／3T3 pcDNA3、NIH／3T3 pcDNA3-MCPCD59-DP和NIH／3T3 pcDNA3-MCPIRESCD59三种转化细胞的特性

2.3 稳定表达的人补体调节蛋白CD59和MCP共同保护NIH／3T3细胞免受人补体溶破作用

3 讨论

第五章 人补体调节蛋白DAF、CD59在NIH／3T3细胞中的共表达及功能研究

0 引言

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.2 实验方法

2 实验结果

2.1 重组表达载体pcDNA3-DAFCD59-DP和pcDNA3-CD591RESDAF的构建及鉴定

2.2 人DAF和CD59 cDNA在转化的NIH／3T3细胞基因组上的整合

2.3 人补体调节蛋白基因DAF和CD59在mRNA水平上的共表达

2.4 人补体调节蛋白基因DAF和CD59在蛋白质水平上的共表达

2.5 人补体调节蛋白DAF和CD59共表达增强NIH／3T3细胞抵抗人补体攻击的能力

3 讨论

第六章 人补体调节蛋白DAF、MCP在NIH／3T3细胞中的共表达及协同作用研究

0 引言

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.2 实验方法

2 实验结果

2.1 pcDNA3-DAFMCP-DP和pcDNA3-MCPIRESDAF重组真核表达载体的构建及鉴定

2.2 人DAF和MCP cDNA在转化的NIH／3T3细胞基因组上的整合

2.3 人补体调节蛋白基因DAF和MCP在mRNA水平上的共表达

2.4 人补体调节蛋白基因DAF和MCP在蛋白质水平的共表达

2.5 共同表达的人补体调节蛋白DAF和MCP保护NIH／3T3细胞免遭人补体的攻击

3 讨论

研究总结

参考文献

博士研究生期间发表的论文

致谢

发布时间: 2006-03-27

参考文献

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