环境基因组来源糖苷水解酶异源表达与底物催化特异性研究

论文摘要

木质纤维素作为自然界最丰富的可再生资源,其有效利用对生产生物基产品、缓解能源危机意义非凡。木质纤维素的高效酶催化水解是实现其生物转化过程的重要步骤,而筛选构建可分别针对特定木质纤维素底物的高效纤维素酶系至为关键。环境基因组学的出现极大地扩展了新酶挖掘的来源范围、大大加快了新酶的发现速度,对木质纤维素利用的意义不言而喻。但通过利用环境基因组策略筛选获得的相关纤维素水解酶还没有被成功用于提高现有纤维素酶系催化效率的报道,这一方面往往与其难以实现高水平的异源表达有关；另一方面也与其功能性质包括催化底物特异性在内的方面缺少深入系统研究有关。因此,本论文从这两个问题出发,初步对密码子使用偏好性这一造成环境基因组来源糖苷水解酶异源表达难的潜在因素及牛瘤胃液基因组文库来源的内切酶Umcel5c2的催化底物特异性进行了研究。实验室先期已经筛选到了五个糖苷水解酶基因,它们分别是：从大象排泄物基因组文库中筛选到的umcel5el和umcel5e2,牛瘤胃液基因组文库中筛选到的umcel5cl和umcel5c2以及土壤基因组文库筛选到得umcel5sl。其中,分属于糖苷水解酶第五家族的Umcel5c2和第九家族的Umcel5el成功地在大肠杆菌中实现了异源表达。在未能获得异源表达的三个基因中,本论文随机选择umcel5e2进行了密码子使用偏好性分析。结果发现宿主与umcel5e2之间存在着密码子使用偏好性差异。论文依据大肠杆菌B系的密码子使用偏好性对umcel5e2进行了优化,人工合成了更适于宿主表达的基因umcel5e2op。但优化后的基因仍然没有得到预期表达,说明密码子偏好性差异不一定是环境基因组来源基因难以异源表达的关键因素。对已经在大肠杆菌中得到表达的Umce15cl进行了纯化,获得了纯化的重组蛋白。对纯化后的Umcel5c2蛋白的酶学性质测定结果显示,与羧甲基纤维素（CMC）相比,Umcel5c2对木葡聚糖表现出更强的催化活性,且其酶促反应动力学特征符合米式酶的特点。进一步运用Swiss-model软件对Umce15c2进行了同源模建,并结合序列比对分析了Umce15c2与最优模板固氮芽胞杆菌来源的木葡聚糖酶pPXG5底物催化特异性存在差异的原因。在此基础上构建了Umce15c2酶蛋白结构表面的三个loop环缺失突变株,并分别测定了它们的反应动力学参数。结果分析表明,Umce15c2表面结构loop环对酶的底物催化特异性影响比较大,且各个loop环的影响程度大小也有差异：loop T170-A179对酶的催化活性影响最大,缺失后酶活力几乎丧失；loop E229-F234对Umce15c2木葡聚糖和羧甲基纤维素的催化水解都非常重要,推测这两个loop环可能直接参与催化水解过程或通过影响催化活性中心构象而影响糖苷键的水解断裂。loopG78-E85虽然在分解木葡聚糖的过程中发挥了一定的作用,但其对CMC的总体降解效率影响不大。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 缩略词表
• 第一章 前言
• 1.1 木质纤维素生物质结构特征
• 1.2 木质纤维素乙醇的生产—方法与挑战
• 1.2.1 木质纤维素乙醇的生产方法
• 1.2.2 木质纤维素乙醇生产面临的挑战
• 1.3 从环境基因组中开发酶资源—进展与问题
• 1.3.1 从环境基因组中筛选糖苷水解酶的进展
• 1.3.2 潜在问题
• 1.4 论文的立题依据与工作思路
• 第二章 环境基因组内切酶的异源表达及密码子使用偏好性分析
• 2.1 材料
• 2.1.1 菌株、质粒和培养基
• 2.1.2 主要试剂
• 2.1.3 主要仪器
• 2.1.4 主要软件
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 糖苷水解酶基因克隆
• 2.2.1.1 引物设计和PCR扩增程序
• 2.2.1.2 基因片段的回收和连接
• 2.2.1.3 大肠杆菌转化及重组质粒筛选
• 2.2.2 糖苷水解酶的异源大量表达
• 2.2.2.1 大肠杆菌表达菌株Rossetta的转化
• 2.2.2.2 蛋白的诱导表达及SDS-PAGE检测
• 2.2.3 密码子优化分析
• 2.2.3.1 大肠杆菌B strain密码子使用频率和各氨基酸使用频率的查找
• 2.2.3.2 待测基因序列中密码子使用频率和各氨基酸使用频率查找
• 2.3 结果与分析
• 2.3.1 环境基因组来源内切酶基因初始序列的异源表达
• 2.3.1.1 Umcel5c2在大肠杆菌中的表达
• 2.3.1.2 Umcel5e1在大肠杆菌中的表达
• 2.3.2 糖苷水解酶的密码子使用偏好性分析、密码子优化及优化后蛋白表达
• 2.3.2.1 异源蛋白的密码子使用偏好性分析
• 2.3.2.2 密码子优化及优化后蛋白的异源表达
• 2.4 本章小结
• 第三章 环境基因组来源糖苷水解酶的纯化及酶学性质初步分析
• 3.1 材料方法
• 3.1.1 菌株、质粒和培养基
• 3.1.2 主要试剂
• 3.1.3 主要仪器
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 粗酶液的制备及SDS-PAGE检测
• 3.2.2 重组蛋白的纯化和保存
• 3.2.3 内切酶酶学性质的初步分析
• 3.2.3.1 最适温度的测定
• 3.2.3.2 最适pH值的测定
• 3.2.3.3 内切酶酶活测定
• 3.2.4 野生型Umcel5c2动力学参数的测定
• 3.2.4.1 Umcel5c2酶促反应动力学类型的确定
• 3.2.4.2 Umcel5c2酶动力学参数的测定
• 3.3 结果与分析
• 3.3.1 糖苷水解酶的表达纯化
• 3.3.1.1 Umcel5e1可溶性蛋白的表达
• 3.3.1.2 Umcel5c2的表达纯化
• 3.3.2 糖苷水解酶酶学性质的初步分析
• 3.3.2.1 Umcel5c2最适温度的测定
• 3.3.2.3 Umcel5c2催化底物范围与酶活力测定
• 3.3.2.3 Umcle5c2催化底物范围与酶活力测定
• 3.3.3 野生型Umcel5c2动力学参数性质测定
• 3.3.3.1 Umcel5c2酶促反应动力学类型的确定
• 3.3.3.2 Umcel5c2酶动力学参数的测定
• 3.4 本章小结
• 第四章 第五家族木葡聚糖酶Umcel5c2底物催化特异性的研究
• 4.1 材料方法
• 4.1.1 菌株、质粒
• 4.1.2 主要试剂
• 4.1.3 主要仪器
• 4.1.4 主要软件
• 4.2 实验方法
• 4.2.1 Umcel5c2同源模建比对
• 4.2.2 Umcel5c2缺失突变株的构建
• 4.2.2.1 基因亚克隆和PCR扩增程序
• 4.2.2.2 DNA片段的回收和连接
• 4.2.2.3 转化和重组质粒的筛选
• 4.2.3 突变株的表达纯化
• 4.2.3.1 粗酶液的制备
• 4.2.3.2 突变株的纯化
• 4.2.4 突变株动力学参数的测定
• 4.3 结果与分析
• 4.3.1 Umcel5c2同源模建比对
• 4.3.2 野生型Umcel5c2底物特异性影响因素分析
• 4.3.3 缺失突变株的构建及动力学参数的确定
• 4.3.3.1 缺失突变株的构建
• 4.3.3.2 突变株的表达纯化
• 4.3.3.3 突变株动力学参数的测定
• 4.4 本章小结与讨论
• 全文总结
• 参考文献
• 致谢
• 学位论文评阅及答辩情况表