抗真菌抗生素生产过程中利迪链霉菌蛋白质组研究

论文摘要

为了更好地研究利迪链霉菌AS 4.2501（Streptomyces lydicus AS 4.2501）生产抗真菌生物活性物过程中细胞的生理和生产特性,本文以S. lydicus AS 4.2501为研究体系,通过考察细胞生产抗真菌活性物质的能力、放大培养过程中细胞内外蛋白组、小分子代谢物,试图从蛋白质组角度探索抗真菌活性物生产过程中细胞生理和生产特性。运用菌丝块法对利迪链霉菌菌丝体、胞外分泌物的抗真菌生物活性进行考察,结果表明无论是菌丝体还是胞外分泌物,S. lydicus E9的抗真菌活性均高于S. lydicus AS 4.2501。2-DE分析表明,在摇瓶培养条件下S. lydicus AS 4.2501与高产菌株S. lydicus E9的胞内、胞外蛋白质变化差异明显。对22个差异显著的蛋白点进行MALDI-TOF-MS鉴定,它们是tetR家族调节蛋白、CIp样ATP依赖性蛋白酶亚基、磷酸甘油变位酶、磷脂酶、5’-脱氧嘧苷三磷酸核苷酸脱水酶、聚磷酸盐葡糖激酶、6-磷酸葡萄糖脱氢酶等,这些蛋白涉及基因翻译转录调节、糖类代谢、磷脂代谢及抗真菌活性物的合成等功能。进一步考察了高产菌株S.lydicus E9从摇瓶到2L和30L放大过程中,不同的发酵阶段细胞胞内、外蛋白组的变化,结果表明生长和生产的不同阶段蛋白质的表达存在明显的差异。MALDI-TOF-MS鉴定了不同阶段差异显著的32个蛋白点,这些蛋白包括乙酰辅酶A乙酰转移酶、羧化酶、乙酰转移酶和鸟氨酸氨基甲酰转移酶等在聚酮途径中具有重要作用的蛋白和腺嘌呤磷酸核糖基转移酶、谷氨酸盐合成酶等,结果表明这种抗真菌活性物质的生产可能是通过聚酮途径合成来实现的。利用GC-TOF-MS对S. lydicus AS 4.2501和S. lydicus E9的小分子代谢物进行了研究,通过PCA分析,初步鉴定出了五种对PCA聚类影响较大的物质,分别是丙三醇、丁四醇、D-半乳糖、葡萄糖醇、D-松二糖。其在抗真菌活性物质生产中的作用有待进一步研究。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 前言
• 第一章 文献综述
• 1.1 农用抗生素
• 1.1.1 农用抗生素的概念
• 1.1.2 农用抗生素的分类
• 1.1.3 农用抗生素的应用现状和开发动向
• 1.2 蛋白质组学及其应用研究进展
• 1.2.1 蛋白质组与蛋白质组学
• 1.2.2 细胞蛋白质组学研究进展
• 1.2.3 胞外蛋白质组学研究进展
• 1.3 代谢物组学及其研究进展
• 1.3.1 代谢物组学及其研究方法
• 1.3.2 代谢物组学的应用
• 1.4 本文的立题背景、意义、依据及主要研究内容
• 1.4.1 立题背景、意义
• 1.4.2 立题依据
• 1.4.3 主要研究内容
• 第二章 抗真菌抗生素的生物活性检测
• 2.1 实验材料与方法
• 2.1.1 菌种
• 2.1.2 实验仪器与设备
• 2.1.3 培养基
• 2.1.4 培养条件
• 2.1.5 菌丝块法测定抗真菌抗生素生物活性
• 2.2 实验设计
• 2.3 结果与讨论
• 2.3.1 AS 4.2501 与S. lydicus E9 发酵液内抗真菌抗生素活性检测
• 2.3.2 AS 4.2501 与S. lydicus E9 菌丝体内抗真菌抗生素活性检测
• 2.2.3 AS 4.2501 与S. lydicus E9 胞外蛋白质的抗真菌活性检测
• 2.4 小结
• 第三章 利迪链霉菌中与抗真菌抗生素合成相关的蛋白质组分析
• 3.1 实验材料与方法
• 3.1.1 菌种
• 3.1.2 实验仪器与设备
• 3.1.3 培养基
• 3.1.4 培养条件
• 3.1.5 主要试剂及溶液配制
• 3.1.6 菌丝体蛋白质的提取
• 3.1.7 胞外蛋白质的提取
• 3.1.8 蛋白质浓度的测定
• 3.1.9 蛋白质二维凝胶电泳
• 3.2 实验设计
• 3.3 结果与讨论
• 3.3.1 胞内蛋白双向凝胶电泳上样量的优化
• 3.3.2 摇瓶培养AS 4.2501 与S. lydicus E9 胞内蛋白质的表达
• 3.3.3 摇瓶培养S. lydicus胞内差异蛋白质的质谱鉴定
• 3.3.4 摇瓶培养AS 4.2501 与S. lydicus E9 胞外蛋白质的表达
• 3.3.5 摇瓶培养S. lydicus胞外差异蛋白质的质谱鉴定
• 3.3.6 S-腺苷蛋氨酸合成酶基因阻断突变株SAM的蛋白质组分析
• 3.4 小结
• 第四章 S. lydicus E9 发酵罐培养过程中的蛋白质组分析
• 4.1 实验材料与方法
• 4.1.1 菌种
• 4.1.2 实验仪器与设备
• 4.1.3 培养基
• 4.1.4 培养条件
• 4.1.5 主要试剂及溶液配制
• 4.1.6 菌丝体蛋白质的提取
• 4.1.7 胞外蛋白质的提取
• 4.1.8 蛋白质浓度的测定
• 4.1.9 蛋白质二维凝胶电泳
• 4.2 实验设计
• 4.3 结果与讨论
• 4.3.1 2L发酵罐培养的S. lydicus E9 胞内蛋白质组分析
• 4.3.2 2L发酵罐培养的S. lydicus E9 胞外蛋白质组分析
• 4.3.3 30L发酵罐培养的S. lydicus E9 胞内蛋白质组分析
• 4.3.4 30L发酵罐培养的S. lydicus E9 胞外蛋白质组分析
• 4.3.5 S. lydicus E9 放大发酵过程中的蛋白质组分析
• 4.3.6 放大发酵培养的S. lydicus E9 胞内差异蛋白的质谱鉴定
• 4.3.7 放大发酵培养的S. lydicus E9 胞外差异蛋白的质谱鉴定
• 4.4 小结
• 第五章 利迪链霉菌中与抗真菌抗生素合成相关的代谢物组分析
• 5.1 实验材料与方法
• 5.1.1 菌种
• 5.1.2 实验仪器与设备
• 5.1.3 培养基
• 5.1.4 培养条件
• 5.1.5 主要试剂
• 5.1.6 胞内小分子代谢物的提取
• 5.1.7 代谢物的衍生化
• 5.1.8 GC-TOF-MS分析条件
• 5.2 实验设计
• 5.3 结果与讨论
• 5.3.1 进样分流比的选择
• 5.3.2 GC-TOF-MS分析结果
• 5.3.3 MarkerLynx软件分析和NIST库检索结果
• 5.4 小结
• 第六章 结论与展望
• 6.1 结论
• 6.2 展望
• 参考文献
• 附录
• 发表论文和参加科研情况说明
• 致谢