肿瘤及凋亡细胞检测的电化学生物传感器研究

论文摘要

肿瘤的发生严重影响着人们的生活质量,危及着人们的生命安全,实现肿瘤细胞及其生理活动的准确、快速、简便检测,对于疾病的确诊与治疗具有非常重要的意义。目前,有关检测方法已有一些报道,但普遍操作繁琐费时、不易定量、仪器昂贵,且要求工作人员有较高的专业技能。本论文设计建立了几种新型的生物传感器,实现了目标物的高灵敏、快速测定。主要内容如下:（1）利用巯基自组装技术制备了压电核酸适体传感器,建立了一种新的检测人脑星形胶质瘤细胞的方法,同时研究了反应体系的热、动力学行为。研究结果表明:星形胶质瘤细胞与压电石英晶体上的核酸适体探针的结合行为很好地符合Langmuir方程,即它们之间的反应是特异性反应,反应的结合常数为6.67×106M-1,25℃时反应速率常数为1.05×105M-1·s-1。该传感器响应的线性范围为1.55×103～3.64×104个/mL,线性回归方程为△f = -41.6-1.32×10-2c,相关系数为0.997,可用于定性、定量检测人脑星形胶质瘤细胞,从而为肿瘤的定级和诊断提供了依据。（2）通过巯基在金表面的混合自组装,将腱肽蛋白c的核酸适体探针固定于金电极表面。基于腱肽蛋白在胶质瘤细胞表面的高表达,利用细胞与电极表面核酸适体探针的特异性生物识别对铁氰化物电化学阻抗的抑制,建立了胶质瘤细胞检测的核酸适体传感器。考察与优化了核酸适体/巯基丙酸混合自组装比例、反应时间、温度和离子强度等对传感器性能有显著影响的分析条件,结果表明该传感器的阻抗响应与胶质瘤细胞浓度呈线性关系,线性范围为100-50000个细胞/mL,检测限可达50个细胞/mL。（3）基于巯基的自组装和纳米金放大技术,将磷脂酰丝氨酸（PS）的识别蛋白Annexin-V固定在金电极表面,构建了Annexin-V修饰电极。实验中将含PS的脂质体与肿瘤细胞进行整合,构建早期凋亡细胞模型;利用整合得到的早期凋亡细胞与电极表面Annexin-V蛋白的特异性生物识别对铁氰化物电化学阻抗的抑制,构建了检测早期凋亡细胞的无标记型电化学阻抗传感器。考察与优化了反应时间、温度、Ca2+浓度等对传感器性能有显著影响的分析条件,在检测5-氟尿嘧啶诱导细胞凋亡率时,达到了与流式细胞仪检测相近的结果。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第1章 绪论
• 1.1 根据生物传感器中敏感材料的识别属性
• 1.1.1 适体传感器
• 1.1.1.1 适体的特点
• 1.1.1.2 适体传感器根据检测信号的不同，可分为光学适体传感器、电学适体传感器等
• 1.1.1.3 适体传感器的发展前景
• 1.1.2 DNA 传感器
• 1.1.2.1 DNA 传感器的基本组成和工作原理
• 1.1.2.2 DNA 在电极表面固定化的方法及特点[31]
• 1.1.2.3 DNA 固定化研究趋势
• 1.2 根据生物传感器的信号获取方式
• 1.2.1 压电生物传感器
• 1.2.1.1 压电传感器的理论基础
• 1.2.1.2 压电生物传感器的应用
• 1.2.1.3 压电生物传感技术的发展趋势
• 1.2.2 电化学阻抗生物传感器
• 1.2.2.1 电化学阻抗谱分析方法的理论基础
• 1.2.2.2 电化学阻抗生物传感器应用及发展趋势
• 1.3 本研究工作的构思
• 第2章 压电核酸适体传感器用于星形胶质瘤细胞的检测研究
• 2.1 前言
• 2.2 实验部分
• 2.2.1 主要仪器和试剂
• 2.2.2 压电核酸适体传感器的制备
• 2.2.3 压电测量与传感器再生
• 2.2.4 晶振的再生
• 2.3 结果与讨论
• 2.3.1 实时结合曲线与洗脱曲线
• 2.3.2 工作曲线
• ass 的测定'>2.3.3 亲合常数K_ass的测定
• 2.3.4 表观反应速率常数Kf 的测定
• 2.4 小结
• 第3章 一种胶质瘤细胞的核酸适体电化学阻抗传感器
• 3.1 前言
• 3.2 实验部分
• 3.2.1 试剂与仪器
• 3.2.2 细胞的培养与计数
• 3.2.3 金电极预处理
• 3.2.4 细胞识别和电化学检测
• 3.3 结果及讨论
• 6^3-/^4-溶液循环伏安行为'>3.3.1 传感器在Fe（CN）₆^3-/^4-溶液循环伏安行为
• 6^3-/^4-溶液中的交流阻抗特性'>3.3.2 传感器在Fe（CN）₆^3-/^4-溶液中的交流阻抗特性
• 3.3.3 电阻抗生物传感器的响应特性
• 3.3.3.1 温度对传感器的影响
• 3.3.3.2 反应时间对传感器的影响
• 3.3.3.3 混合自组装膜比例对传感器的影响
• 3.3.3.4 离子强度对传感器的影响
• 3.3.4 传感器的选择性
• 3.3.5 传感器对不同细胞浓度的响应
• 3.4 小结
• 第4章 一种检测早期凋亡细胞的电化学阻抗传感器
• 4.1 前言
• 4.2 实验部分
• 4.2.1 试剂与仪器
• 4.2.2 纳米金颗粒的制备
• 4.2.3 修饰电极的制备
• 4.2.4 磷脂酸丝氨酸脂质体的制备
• 4.2.5 细胞的培养与计数
• 4.3 结果及讨论
• 6^3-/^4- 溶液中的电化学行为'>4.3.1 传感器在Fe（CN）/₆^3-/^4-溶液中的电化学行为
• 4.3.2 传感器的响应特性
• 4.3.3 早期凋亡细胞模型的构建与检测
• 4.3.4 检测5-Fu 诱导细胞早期凋亡
• 4.4 小结
• 结论
• 参考文献
• 致谢
• 附录 A 攻读学位期间所发表的学术论文目录