低氧性肺动脉高压中亚硝基谷胱甘肽还原酶的表达及其调控机制的研究

论文摘要

新生儿持续性肺动脉高压（Persistent Pulmonary Hypertension of the Newborn,PPHN）是新生儿危重症之一,缺氧是PPHN发生和病情恶化的重要危险因素之一。目前调节血管张力的三条主要途径为:一氧化氮（nitric oxide,NO）/环鸟甘单磷酸（cyclic guanosine monophosphate,cGMP）通路、前列环素/环腺甘单磷酸（cyclicadenosine monophosphate,cAMP）通路和内皮素通路,尤其是NO/cGMP途径是最近PPHN研究的一个热点。作为一种重要的内皮源性舒张因子,它除了激活鸟苷酸环化酶生成第二信使cGMP发挥生物学作用外,现在研究较多的是NO可通过蛋白质巯基硝基化来执行其生理功能。蛋白质巯基硝基化是一种氧化还原依赖的蛋白质翻译后的可逆修饰。许多含有巯基的蛋白可以通过硝基化和去硝基化调节蛋白的生物学活性,从而调节细胞信号的传递。亚硝基硫醇（nitrosothiols,RSNO）是含有硫醇的蛋白和小分子物质硝基化的产物,是体内NO的主要贮存体和载体。亚硝基硫醇浓度的变化和一系列生理病理的改变有关。最近发现乙醇脱氢酶Ⅲ,能特异性分解亚硝基谷胱甘肽（nitrosoglutathione,GSNO）,是目前所知的唯一一种能分解GSNO而不伴随NO释放的蛋白,故又把它命名为亚硝基谷胱甘肽还原酶（GSNO reductase,GSNOR）。GSNO是该蛋白的最佳底物。由于GSNO和其他亚硝基硫醇通过转硝基反应处于动态平衡中,所以GSNOR可以直接控制GSNO的水平,间接控制RSNO水平。三类一氧化氮合酶（nitric oxidesynthase,NOS）是NO和RSNO的主要来源。最近提出一种假说:内源性NO/GSNO/SNO的平衡受NOS-GSNOR双向调控。低氧性肺动脉高压与体内反应性氧化物过度增加、氧化还原平衡破坏和NO/RSNO的缺乏有关。烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶（NADPH oxidase,NOX）尤其是NOX2,4是血管内生成活性氧簇(（reactive oxygen species,ROS）的最主要酶体,在氧化还原信号的传递中起重要的调节作用。硫氢化钠（NaHS）可以补充体内的硫化氢（hydrogen sulfide,H2S）舒张血管,同时也是一种重要的抗氧化剂,干预后可以改变机体的氧化还原状态。RSNO的分解异常与肺动脉高压的研究报道很少,其机制尚不清楚。本课题以野生型和eNOS基因敲除的C57BL/6J小鼠作为研究对象,建立常压低氧的慢性肺动脉高压模型,探讨GSNOR在低氧性肺动脉高压中的变化,同时观察NOX2,4及ROS变化,以及NaHS干预等手段,对其调控机制进行初步的探讨,为肺动脉高压的治疗探索一种新的途径。第一部分低氧性肺动脉高压与亚硝基谷胱甘肽还原酶的表达目的:1.在低氧性肺高压形成过程中,GSNOR在mRNA和蛋白水平表达的变化及相应的酶活性变化。2.GSNOR的表达变化和内皮型一氧化氮合酶（endothelial nitric oxide synthase,eNOS）,诱导型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase,iNOS）之间的关系。3.通过缺氧过程中氧化还原指标还原型谷胱甘肽和氧化型谷胱甘肽的比值（glutathione/glutathione disulfide,GSH/GSSG）和肺组织NO含量的变化,探讨体内氧化还原平衡与肺动脉高压的关系。方法:1.模型建立和分组缺氧组:将C57BL/6J小鼠置于密封有机玻璃箱中,调整氧气和氮气的比例,使箱内氧浓度维持在10%左右。对照组:吸入FiO2为0.21（即空气）,具体方法及实验控制因素同缺氧组。2.评价模型是否成功观察随缺氧时间的延长,外周血pH值和红细胞压积的变化。测量缺氧21天后右心室收缩压的变化,并用α-SMA免疫组化染色观察肺血管的肌化程度,测量右心室与左心室加室间隔的比值[ratio of right ventricle to left ventricle plus septum,RV/（LV+S）]评价右心室肥厚情况。3.荧光定量RT-PCR检测对照组和缺氧1,3,7,14,21天小鼠肺组织GSNOR,eNOS和iNOS在mRNA水平的变化。免疫组化染色观察GSNOR,eNOS和iNOS蛋白在小鼠肺组织内的定位情况。Western blot检测对照组和缺氧1,3,7,14,21天小鼠肺组织GSNOR和eNOS蛋白水平。用生物化学方法,检测肺组织GSNOR活性的变化,GSH/GSSG比值及NO含量的变化。结果:1.缺氧21天后右心室收缩压显著上升（对照组:21.41±1.92 mmHg;缺氧组:32.64±3.56mmHg,P＜0.01）。随着缺氧时间的延长,血pH值下降（P＜0.01）,红细胞压积逐渐上升（P＜0.01）。小动脉的血管壁增厚,非肌型血管出现了不同程度的肌化。RV/（LV+S）的比值显著增加（P＜0.01）。2.GSNOR变化:GSNOR mRNA在缺氧第1天下降（P＜0.05）,缺氧第3天和常氧组无显著差异,缺氧第7天其表达水平为对照组的1.36倍（P＜0.01）,随后逐渐下降。GSNOR蛋白在缺氧第7天显著上升（P＜0.05）,14天达高峰,随后下降。GSNOR酶活性在缺氧7天后显著增加（P＜0.01）。3.NOS变化:eNOS基因在缺氧3天后表达显著增加（P＜0.01）,14天达高峰,随后下降。eNOS蛋白在缺氧3天后表达显著上升。iNOS基因表达的变化和内皮型一氧化氮合酶基因表达变化相一致。4.GSH/GSSG比值及NO含量的变化:缺氧后肺组织GSH/GSSG比值和NO含量均较基础状态出现了显著的下降（分别为P＜0.05和P＜0.01）结论:1.缺氧诱导了GSNOR酶的活性持续升高,是缺氧后肺组织亚硝基硫醇缺乏的原因之一。2.缺氧后eNOS和iNOS的表达增加,而肺组织硝酸根和亚硝酸根浓度下降提示缺氧会导致体内NO缺乏。3.氧化还原平衡破坏参与了低氧性肺动脉高压的发病。第二部分低氧性肺动脉高压时亚硝基谷胱甘肽还原酶表达变化及调控机制研究目的:1.通过对eNOS基因敲除小鼠和野生型小鼠缺氧后及硫氢化钠（NaHS）干预后肺小动脉的重塑和右心室肥厚情况观察,探讨eNOS在肺小动脉的重塑中的作用。2.比较eNOS基因敲除小鼠和野生型小鼠缺氧及干预后GSNOR,iNOS,NOX2,NOX4在mRNA水平的差异。3.通过对eNOS基因敲除小鼠和野生型小鼠缺氧后及干预后肺组织反应性氧化物的变化,进一步证明氧化还原平衡与低氧性肺动脉高压的关系。方法:1.模型建立和分组常氧组:同实验第一部分。缺氧组:将野生型和eNOS基因敲除的C57BL/6J小鼠置于密封有机玻璃箱中,通入氧气和氮气,使箱内氧浓度维持在10%左右。干预组:低氧暴露方法同缺氧组,在缺氧前将硫氢化钠（NaHS）用生理盐水稀释后,以14μmol/kg的剂量腹腔注射,随后一天一次,持续21天。对照组:低氧暴露方法同缺氧组,缺氧前用和干预组同剂量的生理盐水腹腔注射,随后一天一次,持续21天。2.实验指标检测比较野生型和eNOS基因敲除小鼠缺氧及NaHS干预21天后,肺小动脉重塑（观察media wall thickness,MT%）及右心室肥厚的变化。用RT-PCR方法检测GSNOR,eNOS,iNOS,NOX2和NOX4在mRNA水平的变化,用生物化学法检测肺组织反应性氧化物浓度的变化。结果:1.野生型小鼠缺氧21天后,肺组织NOX2,4mRNA水平显著上升（均为P＜0.01）,ROS的浓度显著下降（P＜0.01）。GSNOR的表达在缺氧第7天显著上升（P＜0.05）,随后下降。2.eNOS基因敲除小鼠缺氧21天后NOX2 mRNA的表达显著下降（P＜0.01）而NOX4 mRNA无明显变化。肺组织ROS的浓度无明显变化。iNOS的表达显著上升（P＜0.01）,GSNOR的表达显著下降（P＜0.05）。3.野生型小鼠NaHS干预21天后,MT%和RV/（LV+S）显著下降（分别为P＜0.05,P＜0.01）。野生型小鼠NaHS干预7天后,eNOS和iNOS的表达和缺氧7天组比较显著下降（均为P＜0.01）。干预21天后NOX2和NOX4的表达显著下降（均为P＜0.01）,肺组织ROS的浓度和缺氧组比较略有上升,但无统计学差异。GSNOR的表达也出现了显著下降（P＜0.05）。4.eNOS基因敲除小鼠NaHS干预21天后RV/（LV+S）显著下降（P＜0.05）而MT%变化不明显。NaHS干预21天后,NOX2,4和iNOS mRNA的表达和缺氧21天组比较无差异。肺组织ROS的浓度显著上升（P＜0.01）,GSNOR的表达显著增加（P＜0.01）。结论:1.通过缺氧21天,野生型和eNOS基因敲除小鼠均能成功建立肺动脉高压模型。两者对缺氧的反应程度一致,说明eNOS缺乏后会通过其他途径发生代偿。2.eNOS基因敲除的小鼠缺氧后NOX2和GSNOR的表达下降,NOX4无明显变化,提示eNOS对NOX和GSNOR的表达有诱导作用。3.NaHS对野生型小鼠肺血管重塑的逆转作用比eNOS基因敲除的小鼠明显,说明eNOS在NaHS舒张血管中起到了重要的作用。NaHS干预21天后,两种小鼠肺组织ROS上升,GSNOR的异常表达被部分纠正。GSNOR的过度表达与氧化还原失衡有关。

论文目录

• 致谢
• 摘要
• Abstract
• 缩写词表
• 目次
• 引言
• 第一部分 低氧性肺动脉高压与亚硝基谷胱甘肽还原酶的表达
• 1.1 前言
• 1.2 实验材料和方法
• 1.2.1 材料
• 1.2.2 方法
• 1.3 结果
• 1.3.1 评价肺动脉高压模型的指标的变化
• 1.3.2 GSNOR的变化
• 1.3.3 eNOS在mRNA和蛋白水平的变化
• 1.3.4 iNOS在缺氧不同时间点mRNA和蛋白水平的变化
• 1.3.5 肺组织一氧化氮含量的变化
• 1.3.6 肺组织GSH/GSSG比值的变化
• 1.4 讨论
• 1.5 结论
• 第二部分 低氧性肺动脉高压时亚硝基谷胱甘肽还原酶表达变化及调控机制研究
• 2.1 前言
• 2.2 实验材料和方法
• 2.2.1 材料
• 2.2.2 方法
• 2.3 结果
• 2.3.1 eNOS基因敲除小鼠PCR鉴定结果
• 2.3.2 野生型和基因敲除小鼠缺氧21天及治疗21天后肺血管重塑的变化
• 2.3.3 野生型和基因敲除小鼠缺氧21天及治疗21天后右心室肥厚指标的变化
• 2.3.4 野生型和基因敲除小鼠缺氧及治疗后GSNOR mRNA表达水平的变化
• 2.3.5 野生型和基因敲除小鼠缺氧及治疗后NOX2 mRNA表达水平的变化
• 2.3.6 野生型和基因敲除小鼠缺氧及治疗后NOX4 mRNA表达水平的变化
• 2.3.7 野生型和基因敲除小鼠缺氧及治疗后iNOS mRNA表达水平的变化
• 2.3.8 野生型和基因敲除小鼠缺氧及治疗后eNOS mRNA表达水平的变化
• 2.3.9 野生型和基因敲除小鼠缺氧21天及治疗21天后肺组织反应性氧化物浓度的变化
• 2.4 讨论
• 2.4.1 GSNOR和eNOS及NOX之间的关系
• 2S干预对GSNOR和NOX表达的影响'>2.4.2 H₂S干预对GSNOR和NOX表达的影响
• 2.5 结论
• 全文结论
• 参考文献
• 综述一
• 综述二
• 作者简历及在学期间所取得的科研成果