抗EGFR人源化抗体的构建、表达、纯化和功能分析

论文摘要

表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor, EGFR）是一种跨膜的酪氨酸激酶受体,由N末端的胞外配体结合域,疏水性的跨膜α螺旋结构域（锚定受体于细胞膜上）和胞内的酪氨酸激酶结构域三部分组成,是HER受体家族的一员。当EGFR与配体结合后,胞内酪氨酸激酶结构域就会发生交联磷酸化作用,从而引起下游一系列信号传导通路的活化。EGFR不仅在人体的所有表皮细胞和一些正常组织细胞中表达,且在人体许多实体瘤中出现过表达的现象,受体的表达水平与肿瘤的分化程度、恶性程度、肿瘤的侵润及预后密切相关。所以以EGFR为靶点治疗肿瘤已经成为肿瘤治疗的一个新的热点,市场上也出现了以EGFR为靶点的小分子化学药物和大分子的单抗药物,如抗EGFR的人鼠嵌合抗体Cetuximab。本实验室以Cetuximab为模板,设计合成抗体轻链基因序列和重链可变区基因序列,拼接成完整的轻重链基因并克隆到pIRES双表达载体中,已成功构建出7种表达载体C1-C7,其中的C3（即3#抗体）与抗原的结合能力较高。本研究就是在此基础之上,重新把抗体的4种轻链基因和3种重链基因分别克隆到载体pcDNA3.1（+）和pcDNA3.1（-）上,得到4种抗体轻链基因的表达载体（命名为PL1、PL2、PL3和PL4）和3种重链基因的表达载体（命名为PH1、PH2和PH3）。共转染轻链和重链的表达载体到293T细胞,重组得到12种抗体。ELISA法检测抗体与抗原的结合能力,结果显示7#、10#和11#抗体与抗原的亲和力较高。重新将3#、7#、10#和11#抗体的轻重链基因片段分别克隆到高表达的pcDNA3.1载体上,然后共转染到CHO细胞中,G418抗性筛选稳定单细胞克隆系。Western blot和ELISA法检测抗体的表达和亲和力,结果显示除了3#抗体的结合能力低之外,其它3种抗体与抗原的结合能力都较好。扩大7#、10#和11#抗体的稳定细胞系的培养规模,收集细胞上清,用rProtein A亲和层析纯化浓缩抗体,最终得到110mg的7#抗体、151mg的10#抗体和190mg的11#抗体。Biacore3000技术检测抗体结合抗原的能力,7#、10#、11#、阳性对照Cetuximab抗体与抗原EGFR的KD值分别为3.87×10-9M、8.16×10-8M4.29×10-8M和3.74×10-8M,结果表明人源化抗体与阳性对照相比,与抗原的结合能力处在同一水平上甚至要略好。细胞的划痕实验也表示7#、10#、11#对肿瘤细胞的生长和迁移是有一定的抑制作用。动物实验初步显示这3种抗体都有一定的抑瘤作用。综上所述,本实验成功的构建表达了12种抗EGFR的人源化抗体,其中只有3种抗体与抗原的亲和力较好。对这3种抗体初步进行了初步的分析,实验结果表明人源化抗体对肿瘤细胞的生长和迁移具有一定的抑制作用。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 目录
• 缩略词表
• 引言
• 1、表皮生长因子受体
• 2、肿瘤分子靶向治疗
• 3、治疗性单克隆抗体
• 4、抗EGFR的人源化抗体
• 材料与方法
• 材料
• 1.1 菌株及细胞株
• 1.2 质粒、抗体及工具酶
• 1.3 培养基、试剂及试剂盒
• 1.4 缓冲液
• 1.8 主要仪器设备
• 方法
• 2.1 细胞的培养、传代、冻存和转染
• 2.2 PCR扩增
• 2.3 DNA限制性酶切和DNA片段的连接
• 2.4 DNA片段的琼脂糖凝胶电泳分离
• 2.5 DNA凝胶片段的回收
• 2.6 连接和转化
• 2.7 质粒的小量提取
• 2.8 ELISA检测抗体的表达和亲和力
• 2.9 蛋白质的纯化浓缩
• 2.10 蛋白质的免疫印记实验
• 2.11 Biacore实验
• 2.12 肿瘤细胞的划痕实验
• 2.13 动物实验
• 结果
• 1 表达载体的构建
• 1.1 引言
• 1.2 结果与分析
• 1.3 结论
• 2 抗体的表达和纯化
• 2.1 引言
• 2.2 结果和分析
• 2.3 结论
• 3 抗体的亲和力分析
• 3.1 引言
• 3.2 结果和分析
• 3.3 结论
• 4 肿瘤细胞的划痕实验
• 4.1 引言
• 4.2 结果和分析
• 4.3 结论
• 5 动物实验
• 5.1 引言
• 5.2 结果和分析
• 5.3 结论
• 讨论
• 结论
• 参考文献
• 致谢
• 硕士期间发表的论文综述（第一署名）