黄孢原毛平革菌木质素过氧化物酶基因（lipC）转录调控因子的研究

论文摘要

黄孢原毛平革菌（Phanerochaete chrysosporium）属于白腐担子真菌，是研究木质素生物降解的模式生物，因其具有出色的降解木质素的能力，而且对环境中的有毒物质、爆炸污染物等也有降解作用，因此P. chrysosporium在造纸工业、环境保护等方面具有重要的应用前景。研究表明，P．chrysosporium降解木质素是由众多的胞外过氧化物酶参与的复杂的生物过程，LiP和MnP是主要的2类过氧化物酶。Northern blot和RT-PCR分析表明。这2类酶均受到C、N、O等因素的调节，暗示在其基因的5’-端可能存在顺式调控元件与反式作用因子相互作用调控基因的转录。已有的研究表明，在lipC 5’-端存在2个蛋白质结合元件——PBE1和PBE2。本研究在这一工作的基础上做了如下两方面的研究工作。首先，分别以PBE1、PBE2和PBE1+PBE2为钓饵，利用酵母单杂交技术对低氮培养基中培养3d P. chrysosporium的eDNA文库进行筛选，研究结果表明：以PBE1为钓饵筛选到9个cDNA序列；以PBE2为钓饵筛选到的6个序列；以PBE1+PBE2为钓饵所筛选到10个序列。对这25个eDNA序列进行了较系统的生物信息学分析。结果表明，只有4个序列编码的蛋白质能定位在细胞核中，编号是PBE1-A20.3、PBE1-A12.4、PBE2-A5.1和PBE1-2-A27.1，因此对这4个克隆进行了较深入的分析。序列分析表明，PBE1-A20.3编码一种未知蛋白；PBE2-A12.4编码的蛋白质与多功能蛋白14-3-3有较高的同源性，而14-3-3蛋白参与细胞凋亡、细胞分裂、信号转导、蛋白跨膜转运、基因转录等众多重要生命活动过程，14-3-3蛋白主要以蛋白质一蛋白质相互作用的方式发挥功能。在动物、植物以及酵母中，14-3-3还可以与十字型DNA结合调节DNA复制。功能位点分析表明，PBE2-A5.1编码蛋白质含有1个ATP结合结构域和1个亮氨酸拉链结构，很多调控蛋白质中含有亮氨酸拉链结构，包括CCATT盒及增强子结合蛋白、cAMP应答元件（CRE）结合蛋白、酵母一般调控蛋白GCN4、octamer-结合转录因子2（Oct-2／OTF-2）等。PBE1.2-A27.1编码的蛋白质含HIT（histidine triad）结构域，含该结构的蛋白可以与核酸结合。为进一步鉴定酵母单杂交筛选到的阳性克隆与顺式元件的结合作用，利用pET-28a载体对筛选到的14-3-3蛋白编码序列进行原核生物表达，SDS-PAGE分析表明，14-3-3蛋白在Escherichia．coli BL21中以部分包涵体和部分可溶性形式存在，分子量为33 kD。通过Ni柱纯化得到E.coli中可溶表达的14-3-3蛋白，并用透析和PEG20000浓缩该蛋白用于体外结合实验（GMSA）。表达的14-3-3蛋白与32p标记的PBE1+PBE2探针混合后，经低离子强度聚丙烯酰胺凝胶电泳、放射自显影表明，14-3-3蛋白电泳有明显的延迟现象，当加入40倍的冷探针后，延迟现象减弱，加大14-3-3蛋白量后，延迟现象增强，表明14-3-3蛋白可以与该探针特异结合。在上述研究工作基础上，以14-3-3蛋白为钓饵，利用酵母双杂交技术筛选P.chrysosporium 3d eDNA文库，在SD／-Ade／-His／-Leu／-Trp缺陷培养基平板上共获得了约601个单克隆。进一步分析发现，只有少部分克隆可激活3个报告基因。分离自这些克隆中的质粒DNA转化大肠杆菌，利用HaellI和Sau3AI限制酶切分析可将其分为9类。序列测定和同源分析结果表明，测定的6个序列均具有多个潜在的磷酸化位点，也是14-3-3蛋白潜在的结合位点。其中有2个序列具有WD结构域，表明14-3-3蛋白在P.chrysosporium中也是一个多功能蛋白质。Y2H147与转录因子有一定相似性。高级结构分析显示，P.chrysosporium中的14-3-3蛋白与其它物种中的一样，含有9个Helix结构，且可以形成杯状的同源二聚体结构。蛋白质．蛋白质预测结果显示，14-3-3蛋白可以与Y2H147、389、412号克隆结合，推测14-3-3蛋白在P.chrysosporium中参与多个细胞过程，尤其在基因转录调控过程中发挥某种作用。另外，RT-PCR分析表明14-3-3基因在P.chrysosporium不同代谢阶段没有明显的转录差异。

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摘要

Abstract

第一章黄孢原毛平革菌木质素过氧化物酶基因（lipC）转录调控因子的筛选

摘要

1 引言

2 材料与方法

2.1 实验材料

2.1.1 真菌菌种

2.1.2 大肠杆菌菌种

2.1.3 P.chrysosporium的培养基

2.1.4 酵母培养基

2.1.5 大肠杆菌培养基

2.1.6 质粒载体

2.1.7 引物及钓饵序列

2.1.8 主要试剂和试剂盒

2.2 实验方法

2.2.1 P.chrysosporium的培养

2.2.2 总RNA的提取和mRNA的分离纯化

2.2.3 SMART cDNA的合成及纯化

2.2.4 钓饵质粒的构建

2.2.5 酵母感受态细胞的制备

2.2.6 3-AT浓度的优化

2.2.7 酵母单杂交文库的构建

2.2.8 酵母单杂交文库的筛选

2.2.9 酵母质粒DNA的提取

2.2.10 E.coli感受态细胞的制备和转化

2.2.11 质粒DNA提取

2.2.12 核酸的电泳检测

2.2.13 序列分析

3 结果

3.1 酵母单杂交文库的构建及筛选

3.2 RNA提取及质量检测

3.3 合成cDNA的质量检测

3.4 钓饵质粒的构建

3.5 酵母单杂交筛选P.chryosoporium 3d cDNA文库

3.6 阳性克隆的序列测定及同源性分析

4 讨论

4.1 基因转录调控反式作用因子的研究策略

4.2 基因转录调控反式作用因子的结构特点

4.3 lipC基因转录调控反式作用因子的分析

小结

References

第二章黄孢原毛平革菌中与14-3-3蛋白相互作用蛋白基因的筛选

摘要

1 引言

2 材料与方法

2.1 实验材料

2.1.1 真菌菌种

2.1.2 培养基

2.1.3 主要试剂和试剂盒

2.1.4 质粒载体

2.2 实验方法

2.2.1 E.coli转化

2.2.2 质粒DNA提取

2.2.3 DNA操作

2.2.4 cDNA合成与cDNA文库的构建

2.2.5 重组钓饵质粒的构建

2.2.6 自激活和毒性检测

2.2.7 3-AT浓度的优化

2.2.8 接合实验（mating）筛选阳性克隆

2.2.9 阳性克隆片段的分类

2.2.10 β-半乳糖苷酶活性检测

2.2.11 阳性克隆的验证

3 结果

3.1 酵母双杂交文库的构建及筛选策略

3.2 酵母双杂交cDNA文库质量评估

3.3 酵母双杂交阳性克隆的筛选

3.4 阳性克隆的验证

3.5 阳性克隆片段的分类

3.6 序列测定及序列分析

4 讨论

4.1 酵母双杂交cDNA文库的构建

4.2 14-3-3蛋白的功能

小结

References

第三章酵母单、双杂交阳性克隆的生物信息学分析

摘要

1 引言

2 材料与方法

2.1 数据来源

2.2 主要分析软件及网络资源

2.2.1 分析软件

2.2.2 基因组定位及全长cDNA的预测

2.2.3 网络资源

3 结果

3.1 生物信息学分析策略

3.2 核苷酸序列的同源比对和基因组定位

3.3 氨基酸序列的同源比对及进化树分析

3.4 蛋白质基本性质分析

3.4.1 蛋白质基本常数分析

3.4.2 蛋白质信号肽预测

3.4.3 蛋白质跨膜区预测

3.4.4 蛋白质亚细胞定位分析

3.5 酵母双杂交阳性克隆的磷酸化位点分析

3.6 启动子、转录调控区分析

3.7 功能位点分析

3.8 蛋白质三维结构预测

4 讨论

4.1 酵母单杂交阳性克隆的生物信息学分析

4.2 酵母双杂交阳性克隆的生物信息学分析

小结

References

第四章多功能蛋白14-3-3与顺式调控元件的体外结合分析

摘要

1 引言

2 材料与方法

2.1 实验材料

2.1.1 菌种

2.1.2 质粒

2.1.3 培养基

2.1.4 主要试剂和酶类

2.1.5 引物序列

2.2 实验方法

2.2.1 E.coli转化

2.2.2 质粒DNA提取

2.2.3 DNA操作

2.2.4 重组质粒的诱导表达

2.2.5 His-tag融合蛋白纯化

2.2.6 变性不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS—PAGE）

2.2.7 SDS聚丙烯酰胺凝胶的考马斯亮蓝染色

2.2.8 蛋白浓度测定

2.2.9 DNA探针的标记

2.2.10 DNA探针与菌丝体总蛋白离体结合试验

2.2.11 迁移率转换凝胶电泳

2.2.12 凝胶放射性自显影

2.2.13 RT-PCR分析14-3-3基因转录水平

3 结果

3.1 表达质粒的构建

3.2 14-3-3基因表达产物的SDS-PAGE分析

3.3 14-3-3蛋白的电泳迁移率转换分析

3.4 14-3-3基因在不同培养阶段的转录分析

4 讨论

4.1 凝胶延迟电泳分析DNA-蛋白质结合

4.2 14-3-3蛋白在lipC基因转录调控中的作用

小结

References

文献综述

摘要

第一部分酵母双杂交系统研究进展

引言

1 酵母双杂交系统概述

1.1 酵母双杂交系统的基本原理

1.2 特点与优点

2 应用酵母双杂交系统操作的基本程序

3 酵母双杂交系统的局限性和改进

4 酵母双杂交系统的发展

4.1 酵母单杂交系统

4.2 反向酵母双杂交系统

4.3 酵母三杂交系统

4.4 逆向双杂交系统

4.5 双诱饵系统

4.6 哺乳动物的双杂交系统

4.7 非转录读出特点的酵母双杂交系统

5 主要应用研究进展

5.1 研究蛋白质间的相互作用

5.2 研究蛋白质组及建立蛋白质图谱

5.3 研究细胞信号转导

5.4 在病毒学研究中的应用

5.5 筛选药物和寻找药物靶标

5.6 疾病机理分析

5.7 研究基础分子生物学问题

6 展望

第二部分 14-3-3蛋白研究进展

引言

1 14-3-3蛋白家族的种类

2 14-3-3蛋白分子结构

3 14-3-3蛋白识别序列

3.1 磷酸化丝氨酸/苏氨酸识别序列

3.2 非磷酸化识别序列

4 14-3-3蛋白和配体相互作用的特点

5 14-3-3蛋白的调控机制

6 14-3-3蛋白的生物学功能

6.1 14-3-3蛋白与细胞周期

6.2 14-3-3蛋白与细胞凋亡

6.3 14-3-3蛋白与信号转导

6.4 14-3-3蛋白与线粒体、叶绿体前体蛋白跨膜转运

6.5 功能与表达的多样性

6.6 蛋白质-蛋白质相互作用

6.7 与蛋白激酶构成复合体

6.8 与转录因子相互作用

6.9 与H+-ATPase的作用

7 14-3-3蛋白与疾病

8 14-3-3蛋白的细胞定位

9 展望

References

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致谢

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