生物活性肽PA1b分布及作用机理研究

论文摘要

PA1b（豌豆白蛋白1b）是一37个氨基酸单链多功能的生物活性肽,于1986年首次从豌豆种子中分离与鉴定,其第3、7、15、20、22、和32位点的氨基酸残基为半胱氨酸。它广泛分布于豆科植物中,是一种热稳定性,抗胃蛋白酶、胰蛋白酶水解的生物活性肽。目前已经发现它的主要功能有:1)昆虫毒剂,可杀灭谷类象鼻虫,对人和环境没有危害;2)在植物体内调节愈伤组织的生长和促进细胞分裂;3)具有调节血糖的作用,当注射剂量为5μg/g体重时,PA1b能显著提高正常昆明小白鼠和II型糖尿病模型鼠的血浆葡萄糖浓度。当注射剂量为2.5μg/g体重时能明显降低I型、II型糖尿病模型鼠的血浆葡萄糖浓度。有关三级结构研究显示它属于一种半胱氨酸结的肽类,被命名为cyclotides,有这种结构的肽因为具有潜在的抗生素和抗艾兹病的特性而备受关注。该肽在植物体内参与生长和代谢的调节,其作用模式与动物体内胰岛素和胰岛素样生长因子作用类似。它在大豆种子中可结合7S Bg蛋白,7S Bg蛋白又可以结合动物胰岛素和胰岛素样生长因子。故PA1b又名为Leginsulin,Leginsulin有催化7S Bg蛋白磷酸化的作用。为了进一步研究PA1b分布与功能,及其可能与动物胰岛素系统之间存在的某种关系,我们制备了抗PA1b的单克隆抗体及多克隆抗体,作为对该肽深入研究的重要工具。从豌豆种子中经纯化鉴定得到PA1b后,采用戊二醛二步法将PA1b连结在载体蛋白牛甲状腺球蛋白（BTG）上,用该连结物作为免疫原。用碳二亚胺作交连剂,将PA1b连结在载体蛋白人血清白蛋白（HAS）上,用此连结物作检测抗原。通过皮下多点注射免疫BALB/c小鼠、免疫鼠脾细胞与SP2/0细胞融合、经ELISA方法对阳性克隆细胞进行筛选、并用有限稀释法对分泌抗PA1b抗体的阳性细胞进行多次克隆,得到5株能稳定分泌抗PA1b单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为H9、F6、E5、C7及A10。通过小鼠腹腔注射阳性细胞扩大培养、采集腹水和用辛酸-硫酸胺对腹水进行纯化得到了较纯的单克隆抗体。并对抗体的亚类（亚型）、效价、特异性和亲和力进行了分析,它们属于IgG1和IgG2b亚类,轻链均为κ链,有较好的特异性和较高的亲和力。同时通过免疫新西兰大白兔、收集血清并进行纯化获得了较好的多克隆抗体。应用以上制备的抗体,建立了一种检测PA1b的竟争抑制ELISA方法,这种方法有比用放射性物质标记的放射免疫分析法的优越性,它是通过酶标记二抗来对抗原进行定量分析。在这种方法中,对抗原的结构没有任何破坏。通过一系列已知浓度的PA1b作标准,建立了标准曲线,它检测PA1b的最小检测极限为15nmol/L,线型范围在15nmol/L730nmol/L之间。为了评价这种ELISA,通过比较批内与批间检测到的PA1b量,对批内与批间的差异进行了分析,这种方法平均批内差异为2.81%,批间差异为6.74%,回收率分别是在97.44103.84%和94.87102.72%之间。用上述方法检测了PA1b在多种植物和小鼠的组织中的分布,发现PA1b不但在多中植物中分布,而且在小鼠的某些组织中也存在,这个结果被免疫组织化学、免疫印迹所进一步证实,这是首次证实PA1b跨界存在,开拓了对这一重要多肽激素研究的新领域。另外也发现了在豌豆种子发芽中PA1b含量的变化规律。为了研究PA1b对血糖代谢的调节机理,用表面等离子共振生物传感器、原子力显微镜等技术,对动物组织中是否存在与PA1b相互作用蛋白进行了研究。发现在动物胰腺组织的细胞膜上有与PA1b相互作用的蛋白。并采用亲和层析的方法从猪胰腺细胞膜上纯化得到了该蛋白。用ELISA实验更进一步证实了这个蛋白能够与PA1b结合。通过SDS-PAGE分离、胶内胰酶水解、MALDI-TOF-MASS鉴定后获得这个蛋白的肽指纹图谱。依据肽指纹图谱在蛋白质数据库（http://www.matrixscience.com）中用Mascot Search匹配比较,发现它是一个电压依赖性的阴离子通道蛋白,其分子量为30,737Da。该成果无疑为PA1b调节血糖代谢机理的阐明带来了希望。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 绪论
• 1.1 导言
• 1.2 多肽研究历史上的重要事件
• 1.2.1 胃肠内分泌学发展简史
• 1.2.2 胰岛素和胰岛素样生长因子的研究历史
• 1.2.3 肠促胰岛素的研究历史
• 1.2.4 植物多肽激素的研究
• 1.2.5 另外一些重要多肽的研究历史
• 1.3 新多肽的发现
• 1.3.1 多肽生物活性与发现新肽的一般方法
• 1.3.2 从人体内分离多肽物质
• 1.3.3 从动物体内分离多肽物质
• 1.3.4 从植物体内分离多肽物质
• 1.3.5 从微生物体内分离多肽物质
• 1.3.6 分子水平研究
• 1.4 多肽的研究主要技术
• 1.4.1 分离纯化技术
• 1.4.2 序列组成和结构分析技术
• 1.4.3 蛋白质组功能模式研究技术
• 1.5 多肽的应用
• 1.5.1 生物医药上的应用
• 1.5.2 在食品工业中的应用
• 1.5.3 在科学研究中的应用
• 1.6 PA1b 及相关研究
• 1.6.1 PA1b 的发现及分布
• 1.6.2 碱性7S 球蛋白（Bg 蛋白）的研究
• 1.6.3 PA1b、豆类胰岛素和Bg 蛋白的关系
• 1.6.4 PA1b、豆类胰岛素的生理功能
• 1.7 本研究的意义
• 1.7.1 动物中是否存在PA1b
• 1.7.2 PA1b 调节糖代谢的机制
• 1.8 本研究解决的问题
• 1.8.1 制备抗体建立了免疫学的研究技术平台
• 1.8.2 PA1b 在动植中的分布研究
• 1.8.3 进行PA1b 调节血糖代谢机理的初步研究
• 2 多克隆抗体的制备与纯化
• 2.1 原理
• 2.2 主要材料、试剂及设备
• 2.3 主要操作方法
• 2.3.1 免疫原和包被抗原的制备
• 2.3.2 动物免疫
• 2.3.3 测定血清效价
• 2.3.4 血清采集和多克隆抗体的纯化
• 2.4 实验结果与讨论
• 3 单克隆抗体的制备与鉴定
• 3.1 基本原理
• 3.2 材料
• 3.2.1 生物材料
• 3.2.2 主要试剂
• 3.2.3 主要仪器
• 3.2.4 溶液系统
• 3.3 方法
• 3.3.1 PA1b 的纯化与鉴定
• 3.3.2 PA1b－BTG 的制备
• 3.3.3 PA1b－HSA 的制备
• 3.3.4 免疫动物和效价检测
• 3.3.5 细胞融合
• 3.3.6 选择性培养
• 3.3.7 杂交瘤细胞，瘤细胞染色体鉴别
• 3.3.8 杂交瘤细胞的筛选
• 3.3.9 杂交瘤细胞的克隆
• 3.3.10 单克隆抗体的大量制备
• 3.3.11 单克隆抗体的纯化
• 3.3.12 纯化MAb 的SDS－PAGE
• 3.3.13 杂交瘤细胞的冻存与复苏
• 3.3.14 单克隆株细胞上清和腹水抗体分泌稳定性的研究
• 3.3.15 单克隆抗体的鉴定
• 3.3.16 竟争抑制ELISA 的建立及应用
• 3.4 实验结果
• 3.4.1 PA1b 的制备及纯化
• 3.4.2 抗原的制备
• 3.4.3 免疫动物血清效价的测定
• 3.4.4 融合结果
• 3.4.5 杂交瘤细胞、瘤细胞染色体
• 3.4.6 MAb 的特性鉴定
• 3.4.7 单克隆细胞株分泌抗体稳定性的研究
• 3.4.8 PA1b ELISA 检测方法的建立和竟争抑制ELISA 的应用
• 3.5 讨论
• 4 PA1b 的分布研究
• 4.1 导言
• 4.2 材料
• 4.2.1 主要仪器
• 4.2.2 主要试剂
• 4.2.3 主要溶液
• 4.3 方法
• 4.3.1 用竞争抑制 ELISA 分别测定多种植物和小鼠多种组织提取液中PA1b 的量
• 4.3.2 豌豆种子发芽过程中PA1b 含量的变化
• 4.3.3 免疫组织化学研究小鼠各组织中PA1b 的分布
• 4.3.4 用western-blot 方法研究小鼠多种组织是否存在PA1b
• 4.4 结果
• 4.4.1 ELISA 检测结果
• 4.4.2 western-blot
• 4.4.3 免疫组织化学
• 4.5 讨论
• 5 PA1b 相互作用蛋白的研究
• 5.1 实验原理
• 5.2 材料
• 5.2.1 试剂材料
• 5.2.2 主要仪器
• 5.2.3 主要溶液
• 5.3 方法
• 5.3.1 将PA1b 固定于传感器芯片上
• 5.3.2 生物分子膜制备条件筛选
• 5.3.3 3%BSA 封闭效果的检测
• 5.3.4 膜总蛋白的制备
• 5.3.5 PA1b 与膜蛋白的结合反应
• 5.3.6 亲和柱的制备
• 5.3.7 亲和层析用膜蛋白的提取
• 5.3.8 膜结合蛋白的结合、洗脱、收集及透析
• 5.3.9 亲和柱的再生
• 5.3.10 ELISA 检测洗脱峰的结合特性
• 5.3.11 膜结合蛋白的鉴定
• 5.4 结果
• 5.4.1 原子力显微镜（AFM）检测PA1b 固定于SPR 传感器芯片上的效果
• 5.4.2 BSA 封闭实验结果
• 5.4.3 SPR 传感器应用于不同组织PA1b 膜配体的筛选
• 5.4.4 亲合柱的制备
• 5.4.5 膜蛋白的提取
• 5.4.6 亲合层析
• 5.4.7 ELISA 检测洗脱峰的结合特性
• 5.4.8 膜结合蛋白的初步鉴定
• 5.4.9 膜结合蛋白的胶内水解及肽指纹图谱的获得
• 5.5 讨论
• 6 总结
• 6.1 本研究主要取得了以下几方面的成果
• 6.2 本研究的方法创新点
• 6.3 研究过程中意外发现
• 6.4 研究意义与展望
• 致谢
• 参考文献
• 附录1 攻读博士学位期间发表的论文
• 附录2 英文缩写及中英文全名对照表
• 附录3 常用氨基酸缩写表
• 附录4 博士学习期间参与申请专利情况