茴香霉素对小鼠同种异基因皮肤移植的影响及其机制

论文摘要

目的:研究茴香霉素对小鼠同种异基因皮肤移植的影响及其机制。方法:以活体染料羧基荧光素乙酰乙酸琥珀酰亚胺酯染色,建立在多克隆刺激剂刀豆蛋白A（ConA）刺激下评价小鼠淋巴细胞增殖的模型,通过流式细胞术分析茴香霉素在不同剂量下对体内淋巴细胞增殖能力的影响;取小鼠外周血单个核细胞,利用荧光标记的单克隆抗体双染技术和流式细胞术观察不同剂量的茴香霉素对小鼠体内CD4+Treg的活化以及CD4+CD25+Treg数量的影响;观察茴香霉素对体内CD3+T细胞早期及中期活化标志分子CD69和CD25表达的影响。用Luminex液相芯片技术检测小鼠体内血清中白细胞介素10（IL-10）、白细胞介素2（IL-2）、白细胞介素4（IL-4）、白细胞介素6（IL-6）、白细胞介素12（IL-12）、干扰素γ（IFN-γ）、转化生长因子β（TGF-β）、肿瘤坏死因子α（TNF-α）的表达水平,检测体外淋巴细胞上清中IL-10、IL-2、IL-4、IFN-γ、TNF-α的表达水平,以探明不同浓度茴香霉素对小鼠体内外细胞因子表达水平的影响。用MTT法检测茴香霉素作用下淋巴细胞在单向或双向混合淋巴细胞反应（MLR）中的反应性,并检测以白细胞介素2（IL-2）逆转的淋巴细胞的反应性,以探明茴香霉素免疫抑制作用的可逆性。物理测量不同剂量茴香霉素对小鼠迟发性超敏反应（DTH）的影响。建立C57→Balb/c小鼠同种异基因皮肤移植模型,以环胞霉素（CsA）为阳性对照,观察不同剂量茴香霉素对皮肤移植存活时间的影响。MTT法检测各剂量茴香霉素对淋巴细胞的抑制率。显微镜检测不同剂量的茴香霉素对小鼠骨髓微核以及精子畸形的影响。免疫组化法检测多次注射茴香霉素的小鼠的心、肝、脾、肺、肾的组织形态,以探明茴香霉素的长期毒性。结果:腹腔注射剂量为5.0 mg/kg～60.0mg/kg的茴香霉素能有效抑制ConA对淋巴细胞的促增殖作用（P＜0.05）;相同剂量下,茴香霉素能有效抑制体内CD3+淋巴细胞表面分子CD69和CD25的表达（P＜0.01）,并能使CD4+CD25+Treg明显上调（P＜0.01）;以上剂量的茴香霉素能使小鼠血清中的IL-10、IL-4以及TGF-β明显上升（P＜0.05）,IL-2、IL-12以及IL-6表达水平明显下降（P＜0.01）,IFN-γ以及TNF-α均无显著变化。浓度为1.0 ng/ml～160.0 ng/ml的茴香霉素能使体外培养淋巴细胞的上清IL-10和IL-4显著上升（P＜0.05）,使IL-2、IFN-γ以及TNF-α的水平极显著下降（P＜0.01）;10.0 ng/ml的茴香霉素能明显抑制单向以及双向MLR中淋巴细胞的反应性（P均＜0.01）,其抑制作用与地塞米松比较无明显差异（P＞0.05）;剂量为1.0 ng/ml～160.0 ng/ml的茴香霉素对淋巴细胞的显著抑制作用（P＜0.05）可被50.0ng/ml的IL2部分逆转;12.5mg/kg茴香霉素能够显著延长小鼠皮肤移植存活时间,且明显强于CsA（P＜0.01）;以上剂量的茴香霉素能抑制DTH发生。骨髓微核实验表明,60.0mg/kg的茴香霉素能显著增加Balb/c小鼠的骨髓微核率（P＜0.01）;同样剂量的茴香霉素能引起Balb/c小鼠精子畸变率的明显升高（P＜0.01）;对多次腹腔注射茴香霉素的Balb/c小鼠的病理学检查发现,剂量为5.0 mg/kg～60.0 mg/kg的茴香霉素对Balb/c小鼠的心、肝、脾、肺、肾未有明显的长期毒性。结论:茴香霉素能明显抑制小鼠体内淋巴细胞的增殖、活化和对抗原刺激的反应性,能显著上调小鼠体内的Treg,并诱导体内外Th2型细胞因子的上调以及体外Th1型细胞因子的下调,其抑制作用可以被逆转。茴香霉素能抑制小鼠同种异基因皮肤移植的排斥反应,且作用优于CsA。高剂量的茴香霉素对小鼠产生一定的毒性作用。这些发现可能为其作为新的免疫抑制剂的研发提供理论和实验依据。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 材料与方法
• 1 动物和细胞株
• 2 主要试剂
• 3 主要仪器
• 4 主要溶液的配制
• 5 淋巴细胞的制备
• 6 CFSE染色检测体内淋巴细胞增殖
• 7 双色荧光抗体标记分析体内淋巴细胞CD69和CD25的表达
• +CD25⁺ Treg的表达'>8 双色荧光抗体标记分析体内CD4⁺CD25⁺Treg的表达
• 9 流式细胞仪检测与分析
• 10 Luminex和ELISA检测小鼠血清中细胞因子表达
• 11 Luminex检测淋巴细胞培养上清中细胞因子的表达
• 12 同种混合淋巴细胞反应
• 13 淋巴细胞反应性与IL-2逆转实验
• 14 小鼠同种异基因皮肤移植模型的建立
• 15 迟发型超敏反应
• 16 茴香霉素对小鼠淋巴细胞半数抑制浓度的检测
• 17 姬姆萨染色镜检小鼠骨髓微核率
• 18 姬姆萨染色镜检小鼠精子畸变率
• 19 HE染色观察小鼠心、肝、脾、肺、肾的形态变化
• 20 统计学方法
• 结果
• 1 不同剂量茴香霉素对体内淋巴细胞增殖的影响
• 2 茴香霉素对体内淋巴细胞CD69和CD25表达的影响
• +CD25⁺ Treg的影响'>3 茴香霉素对体内CD4⁺CD25⁺Treg的影响
• 4 茴香霉素对小鼠血清中细胞因子表达的影响
• 5 茴香霉素对体外培养淋巴细胞上清中细胞因子的影响
• 6 茴香霉素对小鼠淋巴细胞反应性的影响
• 7 茴香霉素对淋巴细胞抑制作用的可逆性
• 8 茴香霉素对小鼠移植皮瓣的影响
• 9 茴香霉素对小鼠DTH的影响
• 10 茴香霉素对小鼠淋巴细胞的半数抑制浓度
• 11 茴香霉素引起小鼠骨髓微核率的变化
• 12 茴香霉素引起小鼠精子畸变率的变化
• 13 茴香霉素对小鼠心、肝、脾、肺、肾的长期毒性
• 讨论
• 一、移植排斥的机制
• 二、抗排斥药物的历史与现状
• 三、茴香霉素作为抗排斥药物的理论以及实验依据
• 小结
• 参考文献
• 发表论文
• 致谢
• 英文缩略词表