甘蓝型油菜显性细胞核雄性不育基因Ms/Mf的定位

论文摘要

1985年，李树林等报道了一批新型的甘蓝型油菜细胞核雄性不育材料，它具有败育彻底、不育性稳定、无不良胞质效应等特点；在遗传分析的基础上，认为这些核不育材料的育性是受两对显性基因互作控制的，一对为显性不育基因，一对为显性恢复基因，不育基因单独存在时能够导致不育，但若恢复基因存在时，则育性恢复。因此，显性核不育有保持系和恢复系，可以类似于细胞质雄性不育“三系”法来配制杂交种。最近，宋来强对其发现的显性核不育材料609AB经过深入、系统的研究后，认为甘蓝型油菜显性核不育（包括Rs1046AB）更符合一对复等位基因遗传的假设，使核不育的遗传陷入争论。因此，对显性核不育的深入研究显得非常必要。本研究的主要内容包括：利用Rs1046AB为基础材料，通过杂交、回交和测交的方法对两种遗传假设进行了初步的判别；利用与不育基因连锁的特异标记，展开了核不育纯合两型系的分子标记辅助转育；利用近等基因系Rs1046AB及衍生的F2群体定位了核不育相关的基因，并将结果与前人的相关研究进行了整合。主要的实验结果如下：1．通过不育系Rs1046AB杂交后代的育性分离情况，从16份品系（品种）中，筛选到10份核不育系的临保系，5份核不育系的恢复系；另有一份在恢复基因位点杂合的材料，它能恢复部分单株的育性。2．不育系可育株（Rs1046B）与临保系杂交，F1代可育株自交并继续回交，其F2和BC1代单株全部可育，表明Rs1046B的不育基因与恢复基因在减数分裂中发生分离，因此不育基因与恢复基因为等位基因。不育株（Rs1046A）与恢复系195A-14杂交F2代的20个不育株再与临保系7-5测交，后代育性全部表现不育，证明了该恢复系的恢复基因与不育系的不育基因等位。因此确认核不育系Rs1046AB符合复等位基因的遗传模式，即Rs1046AB不育株的基因型为MsMs，可育株的基因型为MsMf，而临保系的基因型为msms，恢复系195A-14的基因型为MfMf。3．前期按照两对基因互作遗传假设，利用两个与不育基因连锁的SCAR标记，开展了不育基因的标记辅助转育研究。两个受体亲本中，7-5由于在BC1代全部表现为可育，没有分离出预期的不育株而放弃。另一个材料195A是核不育的恢复系，通过标记跟踪和背景选择，在BC2F2代中出现了背景与195A比较一致的核不育株，表明标记辅助转育的过程有效。但是由于获得的不育株存在严重的雌性不孕现象，最终很难得到纯合型不育系。4．利用近等基因系并结合BSA法，对Rs1046AB的137个单株进行了标记分析。在筛选2048对AFLP引物后，获得了6个与恢复基因连锁较为紧密的标记，遗传距离分别为0.7 cM（HDA、HDC和HDF）、1.4 cM（HDB）和3.6 cM（HDE和HDG），且全部位于目标基因同一侧。将遗传距离较近的4个标记中的2个（HDF和HDB）直接转化成稳定的SCAR标记（SCHDF和SCHDB）；而通过侧翼序列分离后，亦将另外2个标记（HDA和HDC）成功转化（SCWA和SCWC）。这些SCAR标记与原始AFLP标记定位到连锁图同一位置。5．利用1017个单株的较大近等基因系群体对彼此共分离的3个SCAR标记（SCWA、SCWC和SCHDF）进行了区分，结果表明：标记SCHDF与恢复基因的遗传距离比标记SCWA和SCWC更近，前者的遗传距离为1.1 cM；但三个标记之间的遗传距离仍然很小。6．为了获得两侧及更近的标记，又利用192个单株的F2群体（Rs1046A／195A-14）构建了显性核不育基因／恢复基因的局部遗传连锁图，它包括20个AFLP标记和2个SCAR标记，一共覆盖10.4 cM的遗传区间。其中14个标记位于Ms／Mf一侧，7个标记位于另外一侧，一个标记与Ms／Mf共分离。Ms／Mf位点两侧最近标记的遗传距离分别为0.1 cM（E3M10-580）和1.0 cM（E1M13-260）。7．根据作图结果，将遗传距离最近的6个标记（S8T13-160、S10T2-90、E3M10-580、S5T5-480、E1M13-260及E14M1-80）中的3个成功转化为SCAR标记，分别是SCDG1（E3M10-580）、SCDG2（S5T5-480）和SCDG3（E1M13-260）。群体分析显示，3个SCAR标记与Ms／Mf位点的遗传距离与原始AFLP标记一致。8．通过对上述两个定位群体中部分标记序列（或侧翼序列）的BLASTn分析，在拟南芥第一染色体短臂顶端鉴定出一个同源区。标记在连锁图上的排列顺序与其同源区在拟南芥上的排列顺序基本一致，表明甘蓝型油菜中核不育相关基因（Ms／Mf）所在区域与拟南芥同源区之间存在着较好的共线性关系，但进化过程中，该区域中亦存在少量的染色体倒位和易位事件。与陆光远和宋来强的标记比对结果进行整合后发现，核不育相关基因的标记同源区，覆盖拟南芥从AT1g04950到AT1g14340之间的大约3.4Mb的物理区间。9．利用相同的SCAR标记或拟南芥同源区的信息，将陆光远的BC1定位群体、宋来强的BC1定位群体及本研究中的两个不同定位群体的定位结果进行了整合。在本研究的F2定位群体的基础上，将宋来强定位群体上的2个SCAR标记整合到的标记ELM2-310和E4M9-150之间；该区域包含核不育相关基因（Ms／Mf），其界定的遗传图距为4.6 cM，共有11个标记（包括5个SCAR标记）。

论文目录

• 缩略词表
• 摘要
• ABSTRACT
• 1 文献综述
• 1.1 雄性不育与油菜杂种优势利用
• 1.1.1 细胞质雄性不育
• 1.1.2 细胞核雄性不育
• 1.2 油菜细胞核雄性不育的研究概况
• 1.2.1 细胞核雄性不育的来源
• 1.2.2 细胞核雄性不育的形态学观察
• 1.2.3 细胞核雄性不育的遗传
• 1.2.3.1 隐性细胞核雄性不育
• 1.2.3.2 显性细胞核雄性不育
• 1.2.4 细胞核雄性不育的分子机理研究
• 1.2.4.1 拟南芥中雄配子发育相关基因的研究进展
• 1.2.4.2 油菜细胞核雄性不育基因的分子机理研究
• 1.3 质量性状的分子标记
• 1.3.1 群体构建及定位策略
• 1.3.2 用于定位的分子标记
• 1.3.3 油菜细胞核雄性不育基因的定位
• 1.3.3.1 隐性细胞核雄性不育基因的定位
• 1.3.3.2 显性细胞核不育相关基因的分子标记定位
• 1.3.4 比较基因组学与基因定位
• 1.4 分子标记辅助选择
• 1.4.1 前景选择
• 1.4.11 用于前景选择的标记
• 1.4.12 前景选择的理想模式
• 1.4.13 前景选择标记的获得
• 1.4.14 侧翼序列克隆主要方法
• 1.4.2 背景选择
• 1.4.2.1 用于背景选择的分子标记数量
• 1.4.2.2 用于背景选择的标记
• 1.5 本研究的目的
• 2 甘蓝型油菜显性细胞核雄性不育纯合两型系的MAS
• 2.1 前言
• 2.2 材料与方法
• 2.2.1 材料
• 2.2.2 用于辅助选择的PCR标记
• 2.2.3 DNA提取和标记分析
• 2.2.4 数据分析
• 2.2.5 田间杂交和标记辅助选择方案
• 2.3 结果与分析
• 2.3.1 亲本的SCAR标记分析
• 2.3.2 F1代单株的育性表现及BC1F1的获得
• 2.3.3 BC1F1代单株的选择
• 2.3.3.1 BC1F1代单株总DNA提取与前景选择
• 2.3.3.2 BC1F1代当选单株的背景选择
• 2.3.4 BC2F1代单株的选择
• 2.3.4.1 BC2F1的前景选择
• 2.3.4.2 BC2F1的背景选择
• 2.3.5 BC2F2单株的选择与表型鉴定
• 2.4 讨论
• 2.4.1 回交育种的标记辅助选择模式
• 2.4.2 两种遗传假设下的MAS方案
• 2.4.3 不育基因对雌性结实的影响
• 3 甘蓝型油菜显性细胞核雄性不育系RS1046AB的遗传
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 遗传分析所用材料
• 3.1.2 材料种植及杂交配组
• 3.2 结果与分析
• 3.2.1 两种遗传假设下纯合型核不育系杂种F1代的育性分离
• 3.2.2 Rs1046AB与不同甘蓝型油菜品系（品种）杂交F1的育性表现
• 3.2.3 杂交F2代及BC1代的育性表现
• 3.2.4 195A-14基因型的判别
• 3.3 讨论
• 3.3.1 显性核不育系Rs1046AB的遗传
• 3.3.2 不育相关基因的等位性判别
• 4 利用近等基因系筛选与核不育恢复基因连锁的分子标记
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 材料
• 4.1.2 单株DNA的提取及DNA混合池的构建
• 4.1.3 AFLP分析
• 4.1.4 AFLP选择性扩增产物的电泳检测
• 4.1.5 AFLP标记的克隆和SCAR转化
• 4.1.5.1 从PAGE上回收差异片段
• 4.1.5.2 连接反应
• 4.1.5.3 感受态细胞制备及质粒转化
• 4.1.5.4 重组子PCR鉴定与测序
• 4.1.5.5 SCAR引物设计与PCR扩增
• 4.1.6 侧翼序列的PCR walking
• 4.1.6.1 抑制PCR法
• 4.1.6.2 T-linker法
• 4.1.7 分子标记数据分析和图谱绘制
• 4.1.8 SCAR标记的大群体验证和不同材料中的检测
• 4.1.9 标记位点与拟南芥基因组序列相似性分析
• 4.2 结果与分析
• 4.2.1 群体单株育性调查结果
• 4.2.2 AFLP引物筛选
• 4.2.3 与不育基因连锁的AFLP标记
• 4.2.4 AFLP标记差异片段的回收、测序和SCAR引物设计
• 4.2.5 部分标记侧翼序列的分离
• 4.2.5.1 基于抑制PCR的侧翼序列分离
• 4.2.5.2 T接头法分离侧翼序列的尝试
• 4.2.6 根据侧翼序列转化SCAR标记
• 4.2.7 SCAR标记的大群体验证
• 4.2.8 三个SCAR标记在不同材料中的扩增
• 4.2.9 恢复基因连锁标记与拟南芥的序列同源性比较
• 4.3 讨论
• 4.3.1 AFLP标记筛选
• 4.3.2 用于质量性状定位的材料选择
• 4.3.3 AFLP片段从胶上的回收
• 4.3.4 SCAR标记的直接转化
• 4.3.5 利用不同的方法对共分离标记的区分
• 5 利用F2群体定位显性细胞核雄性不育基因MS/MF
• 5.1 材料与方法
• 5.1.1 材料
• 5.1.2 DNA提取
• 5.1.3 AFLP分析
• 5.1.4 遗传连锁分析
• 5.1.5 连锁标记的回收、克隆、测序和SCAR标记的转化
• 5.1.6 标记序列与拟南芥序列的比对和作图
• 5.2 结果与分析
• 5.2.1 F2群体育性分离结果
• 5.2.2 AFLP引物筛选
• 5.2.3 连锁标记的群体分析
• 5.2.4 显性细胞核雄性不育MS/Mf位点遗传连锁图的构建
• 5.2.5 部分标记的回收、克隆和SCAR标记转化
• 5.2.6 连锁AFLP标记序列与拟南芥序列的比对分析
• 5.3 讨论
• 5.3.1 F2定位群体的多态性评价
• 5.3.2 不同群体对显性核不育的定位比较
• 5.3.3 甘蓝型油菜含Ms/Mf基因区域与拟南芥基因组的保守性分析
• 参考文献
• 致谢
• 附录
• 作者简介
• 研究生阶段己发表的论文或会议摘要