猪流行性腹泻病毒COE基因乳酸菌表达载体的构建与表达研究

论文摘要

猪流行性腹泻（porcine epidemic diarrhea,PED）是由冠状病毒科、冠状病毒属的猪流行性腹泻病毒（porcine epidemic diarrhea virus,PEDV）引起,猪的一种以腹泻、呕吐和脱水为主要临床特征的高度接触性传染病。PED给世界各国养猪业均带来极大的危害,目前主要采用灭活或弱毒疫苗预防本病,但免疫保护效果不理想,因此,开展PED的基因工程疫苗研究有广阔应用前景。PEDV S糖蛋白是诱导机体产生中和抗体和提供免疫保护作用的主要结构蛋白。PEDV的部分保护性抗原基因（即COE基因）编码的部分S糖蛋白具有抗原性,能够诱导机体产生中和抗体。实践证明,血清IgG、IgM对PED的免疫保护效果不理想,肠道黏膜免疫所产生的分泌型抗体（sIgA）是抵抗PEDV感染的有效抗体。因此,选择安全无毒,能够在肠道中存活并能表达和传递抗原物质的载体系统,有效地刺激黏膜免疫系统产生黏膜免疫应答对本病的防治具有重要意义。本试验选择乳酸乳球菌NZ3900作为受体菌表达外源基因COE,以期获得PEDV口服活菌疫苗,依靠乳酸菌天然的抗菌、抗腹泻作用和S蛋白刺激的特异性黏膜免疫作用,达到预防PED的目的。乳酸乳球菌NZ3900缺失乳糖操纵基因（lacF基因）,与含有lacF基因的乳酸乳球菌表达载体pNZ8149联合使用,以乳糖为选择标记,是一个食品级的外源基因表达系统。本研究用疑似患PED的病猪肠病料,进行RT-PCR扩增,获得531bp的PEDV部分保护性抗原基因,将其克隆入pMD18-T载体后测序,核苷酸序列同PEDV CV777株相应序列的同源性为99.4%。根据测序结果和表达载体特点,设计一对引物,扩增PEDV部分保护性抗原基因（COE基因）501bp。将COE基因与乳酸乳球菌表面表达载体pNZ8149进行连接,电击转化入食品级乳酸乳球菌NZ3900细胞。重组菌以1ng/mL乳链菌肽（Nisin）诱导,通过SDS-PAGE和Western blot分析,PEDV部分S蛋白获得了表达,并具有反应原性。间接免疫荧光实验表明,重组菌表达蛋白定位于菌体细胞表面。试验结果表明,成功的构建了以乳糖为选择标记的食品级表达PEDV部分S蛋白的乳酸菌,重组菌表达蛋白定位于菌体细胞表面并且具有反应原性。为研制预防PED的基因工程乳酸菌口服疫苗奠定了基础。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 第一部分 前言
• 1 猪流行性腹泻研究现状
• 2 猪流行性腹泻疫苗研究现状
• 3 乳酸菌食品级表达系统研究现状
• 4 本研究的目的和意义
• 第二部分 研究部分
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 1.2.1 PEDV部分S基因的扩增
• 1.2.2 PEDV部分S基因的克隆与鉴定
• 1.2.3 表达PEDV COE基因乳酸乳球菌的构建
• 1.2.4 重组乳酸乳球菌COE基因的表达与鉴定
• 2 结果
• 2.1 PEDV部分S基因的扩增结果
• 2.2 PEDV部分S基因的克隆与鉴定结果
• 2.3 表达PEDV COE基因乳酸乳球菌的构建结果
• 2.4 重组乳酸乳球菌COE基因的表达与鉴定结果
• 3 讨论
• 第三部分 结论
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 作者简介