非水介质中β-葡萄糖苷酶催化合成糖苷类活性物质的研究

论文摘要

糖苷具有广泛的生理和药理活性,但在天然产物中含量低满足不了需求,主要通过愈伤组织悬浮培养法和化学合成法获得。由于愈伤组织培养法周期长,化学合成法经多步保护去保护的过程,且产物纯度不高,酶催化合成糖苷具有明显的优势：反应条件温和、产物纯度高,避免化学合成法繁琐的保护和去保护步骤；同时,糖苷受体廉价易得,成本低。因此,生物催化合成糖苷成为研究热点。糖苷酶具有催化糖苷键水解和糖基转移双重活性,可用于合成寡糖、烷基糖苷和芳香基糖苷,以及对氨基酸、多肽、抗生素等进行糖基化修饰。在水相中由于产物糖苷易水解,大大降低了催化合成的效果,相对于水相而言,非水介质用于酶促合成糖苷反应具有明显的优势,通过有效抑制产物的水解反应从而提高收率。本文分别在有机溶剂和离子液体中构建β-葡萄糖苷酶催化糖苷合成反应体系,并优化其催化条件,以期提高红景天甙的产量和收率,为研究酶催化机制和糖苷类活性物质的工业化合成提供理论依据。其主要内容如下：1.通过对固态发酵产酶培养基组分及培养条件进行优化,提高产酶能力。确定了最佳产酶培养基：麸皮8 g,玉米芯2 g,蛋白胨0.3%,水杨苷0.05%,水10mL自然pH。将发酵浸提液经硫酸铵分级沉淀、透析、冷冻干燥获β-葡萄糖苷酶粗酶,该酶的比活从59.94 U/mg提高到164.57 U/mg,纯化倍数为2.75。2.构建了有机溶剂/缓冲液反应体系,并对反应条件进行优化,采用高效液相色谱法为检测手段,考察了聚乙二醇（PEG）修饰的β-葡萄糖苷酶的催化性能。结果表明,PEG-β-葡萄糖苷酶复合物比游离酶对有机溶剂的耐受性增强,催化活性更高,其催化合成的最佳条件为：在正己烷反应体系中,底物浓度酪醇30 mol/L,D-葡萄糖与酪醇摩尔比为1：1,于50℃反应50 h,红景天甙收率最高可达59.2%。为验证该反应体系的适用范围,进行了氢醌的糖苷合成反应。3.构建了离子液体反应体系,离子液体[bmim]PF6对糖苷酶具有良好的生物相容性,同有机溶剂相比,可提高糖苷酶的催化能力,增加底物溶解度,在优化条件（pH5.8,50℃,含水量2%,24h）下,红景天甙产率高达88.5%。离子液体的使用有利于产物分离和酶的重复利用,在该反应体系中酶可重复利用6次,其催化性能下降缓慢。

论文目录

• 中文摘要
• ABSTRACT
• 第一章 绪论
• 1.1 生物催化合成糖苷
• 1.1.1 糖苷化合物的意义及合成方法
• 1.1.2 生物催化合成糖苷及其催化机制
• 1.1.3 糖苷酶非水相催化合成糖苷物质
• 1.2 离子液体中酶催化研究进展
• 1.2.1 离子液体的种类及性质
• 1.2.2 离子液体中酶催化反应类型
• 1.2.3 离子液体用于生物催化的优势（同有机溶剂相比）
• 1.2.4 影响离子液体中酶催化反应的因素
• 1.3 红景天甙研究进展
• 1.4 本课题的研究目的与主要内容
• 第二章 米曲霉β-葡萄糖苷酶的固态发酵培养及性质研究
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 实验材料
• 2.1.2 主要仪器
• 2.1.3 实验方法
• 2.2 结果与分析
• 2.2.1 葡萄糖标准曲线的制定
• 2.2.2 培养基的优化
• 2.2.3 培养条件的优化
• 2.2.4 酶学性质的研究
• 2.3 结论
• 第三章 非水相介质中β-葡萄糖苷酶催化合成红景天甙的研究
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 实验材料
• 3.1.2 主要仪器
• 3.1.3 实验方法
• 3.2 结果与讨论
• 3.2.1 酶活力测定结果
• 3.2.2 红景天甙标准曲线的制定
• 3.2.3 反应介质的选择
• 3.2.4 催化条件的优化
• 3.2.5 产物的分析
• 3.3 小结
• 第四章 非水介质中β-葡萄糖苷酶催化氢醌的研究
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 实验材料
• 4.1.2 主要仪器
• 4.1.3 实验方法
• 4.2 结果与讨论
• 4.2.1 产物的分析
• 4.2.2 反应条件的优化
• 4.3 小结
• 第五章 离子液体中β-葡萄糖苷酶生物催化合成红景天甙
• 5.1 材料与方法
• 5.1.1 实验材料
• 5.1.2 主要仪器
• 5.1.3 实验方法
• 5.2 结果与讨论
• 5.2.1 反应介质的选择
• 5.2.2 红景天甙合成反应的条件优化
• 5.3 小结
• 第六章 结论与展望
• 6.1 主要结论
• 6.2 展望
• 参考文献
• 攻读学位期间取得的研究成果
• 致谢
• 个人简况及联系方式