边缘无浆体病分子诊断ELISA和温氏附红细胞体PCR检测方法的建立

论文摘要

边缘无浆体病和附红细胞体病是影响养牛业的两种主要的寄生虫疾病。两种病的临床表现均表现为贫血、黄疸、食欲不振、消瘦等。边缘无浆体和附红细胞体都是寄生于血液中的寄生虫，染色镜检很难区分，因此本实验室分别建立边缘无浆体和附红细胞体的实验室检测方法用于它们的临床调查。无浆体病（Anaplasmosis）是由边缘无浆体（A.marginle）经蜱传播而引起的一种传染性血液寄生虫病。本病广泛存在于世界各种地理条件之下，本病主要引起牛、羊、鹿等家畜发病，严重的可以致死，牛死亡率可达80％。它是阻碍养牛业发展的几种主要蜱传播疾病中分布最广的一种。本文选取边缘无浆体部分基因构建载体并进行表达，以此表达蛋白为抗原建立边缘无浆体间接ELISA检测方法，用于调查边缘无浆体的流行病学。并为边缘无浆体检测试剂盒的建立奠定基础。根据GenBank公布的边缘无浆体MSP5基因序列（AY714547）设计一对引物，用PCR方法从无菌颈静脉采集姬姆萨染色镜检边缘无浆体为阳性的牛血的DNA模板中扩增MSP5基因582bp的片断。将该片段克隆到原核表达载体pGEX-KG中，构建原核表达载体KG-MSP5，转化BL21，在IPTG的诱导下表达大小约46kD的蛋白。利用BugBuster GST Bind Purification Kit将其纯化，经Western blot分析表明，该蛋白具有良好的免疫反应活性。将可溶性表达产物变性和复性后包被酶标板建立了间接ELISA方法，特异性试验表明其只能特异性地与边缘无浆体反应。与试剂盒（cELISA方法，VMRD，Inc.）同时检测478份临床样品，符合率为98.54％。利用该方法对湖北省、江苏省、新西兰、澳大利亚、加拿大466份临床样品进行调查，结果表明湖北省样品中边缘无浆体阳性率分别为12.89％，而江苏省、新西兰、澳大利亚、加拿大样品中未检测到边缘无浆体。附红细胞体病是由附红细胞体（Eperythrozoon）寄生于多种动物的红细胞表面、血浆及骨髓中引起的一种人畜共患病。关于附红细胞体的分类地位目前仍有争议，传统的分类学方法将附红细胞体列为立克次氏体，但是近年来16S rRNA基因的系统发育分析的结果表明，附红细胞体更接近于支原体（Mycoplasma）。近几年，国内对该病的报道日益增多，它给畜牧业造成巨大的损失。到目前为止，温氏附红细胞体还没有能够纯培养。实验室检测方法也一般以显微镜镜检为主，在红细胞表面或血浆中能看到温氏附红细胞体的存在。但是显微镜镜检的敏感性和特异性较差，而且及易造成假阳性。血清学方法也存在着没有较好的抗原制备方法以及不能区分是否是正在感染虫等局限性。近来，DNA杂交、PCR等实验方法提高了检测方法的灵敏度。为建立特异、敏感、快速的温氏附红细胞体诊断方法，根据本实验室已测得的温氏附红细胞体16S rRNA基因序列（Genbank登陆号为AY946266），设计一对种特异性引物，建立了温氏附红细胞体的PCR诊断方法。特异性试验和敏感性试验表明，此诊断方法只能特异性地扩增温氏附红细胞体的16S rRNA基因序列的特异性片段，检测温氏附红细胞体最低DNA量为1.78fg。利用该方法对湖北省和江苏省温氏附红细胞体感染情况进行了流行病学调查，结果显示阳性感染率分别为10.3％和3.5％，从分子生物学水平证明了温氏附红细胞体在两省的存在。根据临床样品调查结果显示，本文建立的PCR方法比姬姆萨染色镜检准确特异，姬姆萨染色镜检方法易出现假阳性。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 缩略词表
• 第一章 文献综述
• 1.1 边缘无浆体病及其研究进展
• 1.1.1 病原
• 1.1.2 地理分布
• 1.1.3 传播媒介
• 1.1.4 流行病学
• 1.1.5 临床症状
• 1.1.6 病理变化
• 1.1.7 诊断方法
• 1.1.8 预防和治疗
• 1.2 牛附红细胞体病及其研究进展
• 1.2.1 附红细胞体的起源
• 1.2.2 病原学研究
• 1.2.3 附红细胞体的流行病学
• 1.2.4 临床症状
• 1.2.5 诊断方法
• 1.2.6 免疫和预防
• 第二章 边缘无浆体病ELISA诊断方法的建立
• 2.1 目的和意义
• 2.2 实验材料
• 2.2.1 菌种与质粒
• 2.2.2 主要培养基
• 2.2.3 引物
• 2.2.4 酶及试剂盒
• 2.2.5 质粒抽提与鉴定试剂
• 2.2.6 SDS-PAGE相关溶液
• 2.2.7 Western-blot相关溶液
• 2.2.8 ELISA缓冲液
• 2.2.9 边缘无浆体虫体
• 2.3 实验方法
• 2.3.1 边缘无浆体基因组的提取
• 2.3.2 MSP5部分基因的PCR扩增
• 2.3.3 PCR产物的回收与纯化
• 2.3.4 大肠杆菌感受态细胞的制备
• 2.3.5 PCR产物的克隆
• 2.3.6 连接产物的转化
• 2.3.7 质粒的小量制备
• 2.3.8 质粒的大量制备
• 2.3.9 重组质粒的酶切鉴定
• 2.3.10 重组表达质粒pGEX-KG的构建
• 2.3.11 MSP5蛋白的表达与纯化
• 2.3.12 ELISA试验条件的确定
• 2.3.13 ELISA方法的临床应用
• 2.4 结果与分析
• 2.4.1 边缘无浆体MSP5部分基因的PCR扩增
• 2.4.2 MSP5部分基因与PMD18-T载体的连接及鉴定
• 2.4.3 重组质粒的筛选与鉴定
• 2.4.4 重组质粒在E.coliBL21中的表达
• 2.4.5 重组质粒在大肠杆菌中的表达和可溶性分析
• 2.4.6 重组质粒在大肠杆菌中的表达条件的确定
• 2.4.7 Western-blot分析
• 2.4.8 间接ELISA方法的建立
• 2.4.9 ELISA方法的临床应用
• 2.5 讨论
• 2.5.1 边缘无浆体MSP5部分基因的原核表达及ELISA方法的建立
• 2.5.2 临床样品的检测
• 2.5.3 实验中出现的问题
• 2.5.4 检测方法的比较
• 第三章 温氏附红细胞体病PCR诊断方法的建立
• 3.1 研究目的和意义
• 3.2 材料和方法
• 3.2.1 阳性质粒及对照病原
• 3.2.2 试剂和仪器
• 3.2.3 主要试剂与溶液的配制
• 3.2.4 血样的来源
• 3.2.5 姬姆萨染色方法
• 3.2.6 PCR诊断方法
• 3.3 结果
• 3.3.1 姬姆萨染色显微镜检查温氏附红细胞体
• 3.3.2 PCR检测方法结果
• 3.4 讨论
• 3.4.1 PCR方法对温氏附红细胞体病的诊断
• 3.4.2 对 PCR方法的建立
• 3.4.3 湖北省、江苏省温氏附红细胞体的流行病学调查
• 3.4.4 PCR方法与姬姆萨镜检检查方法的比较
• 参考文献
• 致谢
• 附录