日本七鳃鳗CD9分子的基因克隆、表达以及免疫学活性研究

论文摘要

CD9分子是四次跨膜蛋白超家族的成员,目前研究证明,该分子在细胞粘附和机体免疫应答中发挥着重要的作用。作为无颌类脊椎动物的代表之一,日本七鳃鳗因其独特的进化地位而受到人们关注,成为脊椎动物免疫系统起源与进化研究的新型模式生物。目前在七鳃鳗体内,发现有多种与脊椎动物免疫反应以及细胞的分化、增殖、迁移和信号转导相关的同源基因的表达,这些基因的发现对于揭示早期适应性免疫系统的起源具有重要意义。虽然有这么多相关基因的发现,但是对于日本七鳃鳗而言,其CD9分子的免疫相关功能尚不明确。在本篇论文中,作者通过检索日本七鳃鳗白细胞cDNA文库,筛选CD9分子的EST序列,通过基因克隆得到了CD9基因的编码区序列。日本七鳃鳗CD9基因的开放阅读框长684 bp,编码228个氨基酸,通过序列比对表明,它与其它物种中CD9基因具有较高的同源性。Real-time PCR以及免疫组化结果显示,CD9基因在日本七鳃鳗组织中分布广泛,在心脏中的丰度最高,在肝脏,鳃,肾等组织中也有不同程度的表达。使用LPS免疫七鳃鳗后,其肝脏和心脏中CD9的mRNA表达水平呈显著上调趋势,这表明CD9在这些组织中发挥着免疫调控的作用。免疫共沉淀的结果显示,日本七鳃鳗CD9和CD29可以在肠里发生相互作用。流式细胞术结果显示,CD9分子表达于日本七鳃鳗白细胞,并且在粒细胞中的表达水平要高于淋巴细胞,这预示着CD9分子可能在日本七鳃鳗的固有免疫应答中发挥着更多的功能。本文研究结果表明,日本七鳃鳗CD9在各个组织中有着较为广泛的分布并且在七鳃鳗的免疫应答发挥着一定的作用,这些为日后无颌类脊椎动物免疫应答和进化方面的研究提供了参考。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 文献综述
• 1.1 CD9 的结构
• 1.2 CD9 的生物学功能
• 1.3 CD9 与免疫细胞的关系
• 1.3.1 CD9 与T 细胞
• 1.3.2 CD9 与B 细胞
• 1.3.3 CD9 与DC
• 1.4 CD9 与免疫活性因子的关系
• 1.4.1 CD9 与MHC
• 1.4.2 CD9 与其它CD 分子的相互作用
• 1.5 CD9 分子的系统进化
• 1.6 结语
• 2 日本七鳃鳗CD9 基因的克隆、生物信息学分析以及蛋白表达
• 2.1 材料和方法
• 2.1.1 日本七鳃鳗CD9 基因克隆
• 2.1.2 日本七鳃鳗CD9 基因生物信息学的分析
• 2.1.3 日本七鳃鳗CD9 基因片段的蛋白表达以及纯化
• 2.2 结果
• 2.2.1 日本七鳃鳗CD9 基因克隆及生物信息学分析
• 2.2.2 日本七鳃鳗CD9 片段的蛋白表达以及纯化
• 2.3 讨论
• 3 日本七鳃鳗CD9 基因real-time PCR 的分析
• 3.1 材料和方法
• 3.2 结果
• 3.3 讨论
• 4 兔抗日本七鳃鳗CD9 分子多克隆抗体的制备以及与其相互作用蛋白的研究
• 4.1 材料和方法
• 4.1.1 免疫程序的制定
• 4.1.2 利用ELISA 对抗体效价的检测
• 4.1.3 Western blot 鉴定
• 4.1.4 免疫血清的收集以及纯化
• 4.1.5 CD9 与CD29 的免疫共沉淀
• 4.2 结果
• 4.3 讨论
• 5 日本七鳃鳗CD9 分子免疫组化和流式细胞术的分析
• 5.1 材料和方法
• 5.1.1 石蜡切片的制备
• 5.1.2 免疫组化染色
• 5.1.3 流式细胞术
• 5.2 结果
• 5.2.1 免疫组化染色
• 5.2.2 流式细胞术
• 5.3 讨论
• 6 结论
• 6.1 主要结论
• 6.2 创新点
• 参考文献
• 攻读硕士学位期间发表学术论文情况
• 致谢