三种针叶树种遗传转化受体系统的建立及农杆菌介导的遗传转化研究

论文摘要

马尾松和杉木为我国东部主要的常绿针叶树,也是重要的造林和经济用材树种;杂交松是通过基因重组培育出来的松树杂种,杂种优势极为突出,是值得大力推广的优良树种。开展细胞组织培养及遗传转化研究,对它们的快速繁育、良种选育和抗病虫害研究工作都具有重要的理论意义与实践价值。以马尾松、杂交松和杉木三种针叶树种不同种源基因型的不同外植体进行了再生能力的比较,系统分析了不同基本培养基、不同植物生长调节剂及其浓度对不定芽和不定根诱导效率的影响,优化了各个树种体外植株再生的适应条件;并研究探索了以马尾松初生茎顶组织和杉木茎段为受体材料进行的农杆菌介导的遗传转化,系统研究了抗生素、预培养和共培养时间、侵染菌液浓度及时间、添加乙酰丁香酮及筛选方式等因素对转化效率的影响。主要得到了如下结果及创新进展:①建立了马尾松成熟合子胚及初生茎顶组织的高效器官发生和植株再生体系;②采用初生茎顶组织再生体系为受体系统,首次进行了马尾松的遗传转化研究并得到了初步结果,建立了一个新的农杆菌介导的针叶树种遗传转化体系;③首次建立了杂交松成熟合子胚、子叶及茎段的高效再生体系;④研究建立了杉木成熟合子胚、茎段的高效再生体系并首次由杉木茎段诱导出直接体细胞胚胎发生;⑤利用杉木茎段再生体系为受体系统,进行了杉木的遗传转化研究并得到了初步结果。

论文目录

• 摘要
• 文献综述
• 1. 植物生物技术在林木遗传改良中的应用
• 引言
• 1.1 林木细胞和组织培养
• 1.1.1 器官发生途径
• 1.1.2 体细胞胚胎发生途径
• 1.2 林木遗传转化
• 1.3 林木分子标记技术
• 2. 针叶树遗传转化的研究进展综述
• 引言
• 2.1 农杆菌介导的针叶树遗传转化
• 2.2 基因枪法
• 2.2.1 瞬时表达
• 2.2.2 稳定表达
• 2.3 电穿孔法
• 2.4 影响针叶树转化的一些主要因素
• 参考文献
• 第一部分:马尾松、杂交松和杉木的细胞组织培养研究
• 前言
• 摘要
• 材料和方法
• 1. 植物材料
• 2. 培养基和培养条件
• 2.1 马尾松直接器官发生培养基及培养条件
• 2.2 杂交松直接器官发生培养基及培养条件
• 2.3 杉木器官发生及体细胞胚胎发生培养基及培养条件
• 3. 数据统计方法
• 3.1 不定芽的诱导频率
• 3.2 诱导的平均不定芽数
• 3.3 不定芽的形成能力
• 4. 石蜡切片方法
• 结果和讨论
• 1. 马尾松高效再生体系的建立
• 1.1 马尾松基因型的选择
• 1.2 基本培养基和细胞分裂素对马尾松成熟合子胚不定芽诱导的影响
• 1.3 BA 和TDZ 浓度对马尾松初生茎顶组织芽诱导的影响
• 1.4 影响马尾松不定芽伸长的因素
• 1.5 影响马尾松不定根诱导的因素与植株再生
• 1.6 马尾松成熟合子胚不定芽发生的组织学分析
• 2. 杂交松高效再生体系的建立
• 2.1 基本培养基及细胞分裂素对杂交松成熟合子胚不定芽发生的影响
• 2.2 BA、TDZ 浓度对杂交松试管苗子叶和茎段芽诱导的影响
• 2.3 影响杂交松不定根诱导的因素与植株再生
• 3. 杉木高效再生体系的建立
• 3.1 杉木基因型的选择
• 3.2 杉木成熟合子胚和茎段的芽诱导过程及体外植株再生
• 3.2.1 杉木成熟合子胚培养直接不定芽发生及植株再生
• 3.2.2 杉木茎段不定芽和腋芽的诱导及体外植株再生
• 3.3 杉木茎段培养直接体细胞胚胎发生
• 4. 讨论
• 参考文献
• 第二部分:农杆菌介导的马尾松和杉木遗传转化研究
• 前言
• 摘要
• 材料和方法
• 1. 植物材料及外植体再生
• 2. 菌株和质粒
• 3. 细菌培养基、酶及生化试剂
• 4. 菌株培养
• 5. 转化步骤
• 6. 转化体的筛选和抗性芽的再生
• 7. 转基因马尾松芽苗、杉木芽苗的鉴定
• 7.1 GUS 染色分析
• 7.2 植物基因组DNA 的提取
• 7.2.1 方法与步骤
• 7.2.2 母液与DNA 提取液
• 7.3 聚合酶链式反应（PCR）分析
• 结果和讨论
• 1. 不同抗生素浓度对芽分化的影响
• 1.1 抑菌抗生素对芽分化的影响
• 1.2 筛选抗生素的本底抗性实验
• 2. 预培养时间对转化的影响
• 3. 侵染农杆菌菌液及侵染时间对转化的影响
• 4. 共培养时间对转化的影响
• 5. 共培养培养基pH 值对转化的影响
• 6. 添加添加乙酰丁香酮（AS）对农杆菌介导转化的影响
• 7. 筛选方式对产生抗性芽的影响
• 8. 稳定转化及抗性芽苗的获得
• 9. GUS染色分析
• 10. 抗性芽苗的PCR检测
• 11. 讨论
• 参考文献
• 结论
• 攻博期间文章目录
• 缩写列表
• 致谢