抑制肥大细胞类胰蛋白酶表达对血管内皮细胞合成、分泌炎症介质的影响

论文摘要

动脉粥样硬化是一种慢性炎症性疾病。在动脉粥样硬化病变过程中,单核细胞进入血管内膜分化为巨噬细胞并释放多种细胞因子,进一步趋化、聚集白细胞,并使白细胞迁移进入血管内膜,合成、释放大量细胞因子和炎症介质,损害血管内皮细胞功能。在血管炎症发展过程中,肥大细胞从血管周围迁移进入内膜并被激活。活化的肥大细胞通过脱颗粒的方式释放多种分泌型介质,包括类胰蛋白酶、糜蛋白酶、组胺和肝素。类胰蛋白酶是一种具有多种生物学活性的天然蛋白酶。在心血管系统中,类胰蛋白酶激活平滑肌细胞、内皮细胞和心肌细胞上的PAR-2,引起血管舒张和收缩,细胞有丝分裂,细胞内钙离子浓度升高,von Willebrand因子释放以及一氧化氮释放等生物学效应。类胰蛋白酶与动脉粥样硬化的发生发展密切相关。类胰蛋白酶能够招募中性粒细胞,启动炎症反应;能够刺激内皮细胞合成IL-1β和IL-8,并促进IL-8的释放,通过IL-8的作用进一步促使白细胞聚集、浸润,参与血管炎症反应。血管内皮细胞功能的紊乱和失调是动脉粥样硬化血管炎性病变的早期病理改变。在这一过程中,单核-巨噬细胞、平滑肌细胞和内皮细胞合成并分泌多种炎症介质,破坏内皮细胞功能,增强内皮细胞层通透性,促进血管炎症发展。在这些炎症介质中,IL-6和TNF-α对促进动脉粥样硬化血管炎性病变的形成和发展起了非常重要的介导作用。IL-6通过刺激肝脏,诱导C反应蛋白大量生成,参与动脉粥样硬化的早期炎症反应。TNF-α是炎症反应中最重要的启动因子之一,通过激活NF-κB,促进多种炎症介质释放,使炎症反应产生级联效应,介导血管炎症的发展。研究证实,类胰蛋白酶通过激活细胞膜上的PAR-2促进单核细胞合成并分泌IL-6、TNF-α和IL-1β,从而影响动脉粥样硬化的血管炎性病变过程。本实验室证实,类胰蛋白酶通过激活PAR-2上调血管内皮细胞IL-6和TNF-α的mRNA表达及蛋白分泌,并呈时间依赖性和浓度依赖性。本实验中,我们运用RNA干扰的方法,根据类胰蛋白酶序列设计siRNA片段,将siRNA-载体转染肥大细胞P815,通过RT-PCR检测P815细胞中类胰蛋白酶的mRNA表达。结果显示,RNA干扰能够明显抑制P815细胞表达类胰蛋白酶。在建立P815细胞类胰蛋白酶表达抑制模型的基础上,我们制作、收集类胰蛋白酶正常表达（P815条件培养液）和类胰蛋白酶表达抑制（siRNA-P815条件培养液）两种不同的条件培养液,并通过ELISA检测不同条件培养液中类胰蛋白酶的含量。结果显示,siRNA-P815条件培养液中类胰蛋白酶含量明显低于P815条件培养液。我们用不同条件培养液培养bEnd.3细胞后,分别通过RT-PCR和ELISA检测bEnd.3细胞IL-6和TNF-α的mRNA表达及蛋白分泌。结果显示,用siRNA-P815条件培养液培养的bEnd.3细胞,其IL-6和TNF-α的mRNA表达水平及蛋白分泌水平明显低于用P815条件培养液培养的细胞,而略高于用DMEM培养液培养的细胞。实验证明,肥大细胞类胰蛋白酶能够促进血管内皮细胞合成并分泌IL-6和TNF-α;抑制类肥大细胞胰蛋白酶表达能够明显下调血管内皮细胞合成并分泌IL-6和TNF-α。肥大细胞类胰蛋白酶在心血管疾病特别是动脉粥样硬化中的作用正受到越来越多的关注。本实验证实,类胰蛋白酶能够影响血管内皮细胞对重要炎症介质IL-6和TNF-α的表达,从而参与动脉粥样硬化的血管炎症病变过程。本实验运用RNA干扰的方法降低类胰蛋白酶表达,从而抑制动脉粥样硬化相关炎症介质的产生,为动脉粥样硬化的治疗提供了新的靶点。高脂血症是血中脂质浓度超过正常范围的疾病。血清中的T-CHO、TG、LDL增高以及HDL降低都是高脂血症的表现。高脂血症可以引起血管内皮细胞损伤。正常的血管内皮细胞合成并分泌包括eNOS和HO-1在内的多种内源性保护酶,对抑制血管炎症反应,保持血管结构稳定以及维持血管舒缩功能平衡均起到重要作用。eNOS水解精氨酸产生的一氧化氮是公认的血管扩张剂,起到维持血管张力、调节血压稳定、抑制血小板凝集、抑制白细胞聚集黏附和抑制血管平滑肌细胞增殖等多种作用,对减缓各种慢性炎症性心血管疾病的发生发展具有重要意义。HO-1通过降解血红素生成一氧化碳,胆绿素和Fe2+,具有抗氧化应激和炎症损伤、抑制细胞增殖和凋亡等作用,并参与血管舒缩功能的调节。高脂血症时,血液高脂质环境和内皮细胞功能紊乱可能影响eNOS和HO-1的表达,进而改变两者下游产物比如NO及CO的生成,从而影响各种慢性炎症性心血管疾病的发生发展。本实验分别以高脂饲料和普通饲料喂养C57BL/6小鼠,18w后测定小鼠血清中T-CHO、TG、HDL和LDL浓度。结果显示,高脂饮食组小鼠的血清T-CHO、TG和LDL浓度均高于普通饮食组小鼠,而HDL浓度低于普通饮食组小鼠,表明高脂饲料喂养的小鼠能够形成明显的高脂血症。在建立高脂血症小鼠模型的基础上,我们通过Real-Time PCR的方法测定两组小鼠心脏组织和肺组织中eNOS和HO-1的mRNA表达,通过免疫组化的方法测定eNOS和HO-1在组织中的蛋白表达。结果显示,高脂饮食组小鼠心脏和肺组织中eNOS的mRNA和蛋白表达明显低于普通饮食组小鼠,而HO-1表达则高于普通饮食组小鼠。实验证明,高脂饮食导致的高脂血症能够引起小鼠心脏和肺组织中的eNOS表达降低,而HO-1表达升高。高脂血症导致的eNOS表达下调使NO生成减少,减弱了NO对血管内皮功能的保护作用。而此时诱生型酶HO-1的表达上调可能作为一种调节代偿机制存在于病变发展过程中。但是这种代偿机制如何启动并通过何种途径实现,需要进一步探讨与研究。在持续的高血脂环境刺激下,自身代偿机制往往无法逆转细胞损伤及器官病变,因此能否通过输入外源性保护酶或大量诱导内源性保护酶生成以干预病变的发展,值得进一步研究。

论文目录

• 英文缩写词
• 第一部分 抑制肥大细胞类胰蛋白酶表达对血管内皮细胞合成、分泌炎症介质的影响
• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 结论
• 参考文献
• 第二部分 高脂血症对小鼠eNOS和HO-1表达的影响
• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 结论
• 参考文献
• 综述 肥大细胞和类胰蛋白酶与心血管疾病
• 附录 试剂配制
• 致谢