一株嗜酸真菌的分离鉴定及其两种苷酶的酶学性质

论文摘要

嗜酸微生物是极端环境微生物的重要类群,在酸性环境中发挥着重要的生态作用,对人们的生活生产具有潜在的生物技术价值。本研究从新疆某矿区铀矿酸性废水分离出一株真菌。依据ITS序列并结合形态特征分析,该菌株初步鉴定为Penidiella sp.,暂命名为Penidiella sp.HEY-1。该菌株的最适生长pH值为3.0～4.0,在pH值2.0也能较好生长,具有嗜酸性。以麸皮和豆渣为基质进行发酵产酶研究,该菌株能分泌产生木聚糖酶、淀粉酶、果胶酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶以及β-葡萄糖苷酶等糖苷水解酶。是一株具有应用潜力的工业用酶产生菌。初步建立了能诱导菌株Penidiella sp.HEY-1同时产生上述六种酶的发酵方法。通过优化培养基中麸皮和豆渣的组成比例、培养的pH值和温度,建立了4种培养方法。方法1：只添加麸皮,pH值2.0,培养温度20℃,高产木聚糖酶。方法2：麸皮与豆渣比例为1：1,pH值2.5,培养温度25℃,高产淀粉酶、果胶酶。方法3：麸皮与豆渣比例为1：1,pH值4.0,培养温度30℃,高产α-半乳糖苷酶。方法4：只添加豆渣,pH值3.0,培养温度30℃,高产β-半乳糖苷酶和β-葡萄糖苷酶。采用乙醇沉淀、DEAE-Sepharose Fast Flow离子交换层析与Sephadex G-100凝胶过滤层析等步骤后获得了凝胶电泳均一的α-半乳糖苷酶和β-葡萄糖苷酶,它们的相对分子质量分别为52.5 kDa、65.5 kDa,比活分别为15.83 U/mmg和3.30U/mg、纯化倍数分别为15.05和4.52、回收率分别为14.6%和2.2%。α-半乳糖苷酶反应的最适温度为60℃,最适pH值为3.0,在60℃以下及pH值2.0～6.0范围内能保持稳定。Ba2+、Fe2+、Mg2+、Zn2+、Ca2+、Cu2+和K+对酶活有明显的激活作用,Mn2+和Fe3+对酶活性有极强的抑制作用,Hg+和Na+几乎完全抑制了酶活性。该酶可作用对-硝基苯-α-D-半乳糖苷（pNPGal）、棉籽糖和水苏糖,该酶作用于pNPGal的米氏常数（Km）值为0.768 mmol/L,酶促反应的最大速度（Vmax）为1.55×10-3mol/（L·min）。β-葡萄糖苷酶反应的最适温度为60～70℃,最适pH值为3.0,在70℃以下及pH值2.0～8.0范围内均能保持稳定。Mn2+对酶有激活作用,K+、Fe3+微弱的激活作用,而Na+对酶有明显的抑制作用,其他金属离子对酶的活性影响不大。该酶作用于对硝基苯-β-D-葡萄糖苷（pNPGlu）、邻硝基苯-p-D-半乳糖苷（oNPG）的米氏常数（Km）值分别为0.434 mmol/L和0.411mmol/L,酶促反应的最大速度（Vmax）分别为1.0×1O-3和3.3×10-4mol/（L·min）。研究表明α-半乳糖苷酶和β-葡萄糖苷酶均具有嗜酸性,可以应用于饲料、食品和医学等领域。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 目录
• 第一章 引言
• 1.1 极端微生物
• 1.2 嗜酸微生物的研究现状
• 1.2.1 嗜酸微生物的来源
• 1.2.2 嗜酸微生物的分类
• 1.2.3 嗜酸微生物及其嗜酸酶的应用
• 1.3 α-半乳糖苷酶的研究进展
• 1.3.1 α-半乳糖苷酶的来源
• 1.3.2 α-半乳糖苷酶的分类
• 1 3.3 微生物产α-半乳糖苷酶的诱导
• 1.3.4 α-半乳糖苷酶的理化性质
• 1.3.5 α-半乳糖苷酶的应用前景
• 1.4 β-葡萄糖苷酶的研究进展
• 1.4.1 β-葡萄糖苷酶来源
• 1.4.2 β-葡萄糖苷酶的分类
• 1.4.3 β-葡萄糖苷酶理化性质
• 1.4.4 β-葡萄糖苷酶的应用及前景展望
• 1.5 本研究的内容、目的和意义
• 1.5.1 研究内容
• 1.5.2 研究目的和意义
• 第二章 菌株分离鉴定及其产胞外糖苷水解酶类分析
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 菌样来源
• 2.1.2 引物合成
• 2.1.3 试剂盒、工具酶和生化试剂
• 2.1.4 培养基
• 2.1.5 实验仪器
• 2.1.6 溶液
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 菌株的分离与鉴定
• 2.2.2 糖苷水解酶的发酵产酶分析
• 2.3 结果与分析
• 2.3.1 菌株分离与鉴定
• 2.3.2 发酵产酶分析
• 2.4 讨论
• 本章小结
• 第三章 α-半乳糖苷酶的分离纯化及其酶学性质
• 3.1 实验材料
• 3.1.1 菌株来源
• 3.1.2 生化试剂
• 3.1.3 培养基
• 3.1.4 实验仪器
• 3.1.5 溶液
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 α-半乳糖苷酶的分离纯化
• 3.2.2 分析方法
• 3.2.3 α-半乳糖苷酶的酶学性质
• 3.3 结果与分析
• 3.3.1 α-半乳糖苷酶的分离与纯化
• 3.3.2 α-半乳糖苷酶的酶学性质
• 3.4 讨论
• 本章小结
• 第四章 β-葡萄糖苷酶的分离纯化及其酶学性质
• 4.1 实验材料
• 4.1.1 菌株来源
• 4.1.2 生化试剂
• 4.1.3 培养基
• 4.1.4 实验仪器
• 4.1.5 溶液
• 4.2 实验方法
• 4.2.1 β-葡萄糖苷酶的分离纯化
• 4.2.2 分析方法
• 4.2.3 β-葡萄糖苷酶的酶学性质
• 4.3 结果与分析
• 4.3.1 β-葡萄糖苷酶的分离与纯化
• 4.3.2 β-葡萄糖苷酶的酶学性质
• 4.4 讨论
• 本章小结
• 全文结论
• 致谢
• 参考文献
• 攻读学位期间的研究成果