论文摘要
原发性高血压（essential hypertension,EHT）是当今社会最常见的心血管疾病,与冠心病、脑卒中、心力衰竭和肾功能障碍密切相关,是导致多种心血管疾病死亡的主要危险因素之一,其患病率在我国有逐年增高的趋势。线粒体病由于突变的线粒体逐渐积累,导致线粒体氧化磷酸化功能受损,细胞功能下降。线粒体tRNA突变是线粒体疾病的研究热点之一。线粒体含有22种tRNA。既往的研究也发现原发性高血压具有家族聚集倾向性,其中一些具有明显母系遗传特点,而且线粒体疾病往往同时表现血压升高,提示我们线粒体DNA（mitochondrial DNA,mtDNA）突变可能与血压升高有一定的相关性。我们对2000名原发性高血压患者进行了测序分析,其中发现一个具有典型母系遗传特点的大家系,我们收集了5代104人,其中母系成员27人。我们对家系成员的一般情况、血压等进行测量和统计,对其中42A人进行全身体格检查、采血进行生化和心脏超声检查。结果发现该家系中母系成员高血压患病率高达55.6%,非母系成员高血压患病率15.6%（P＜0.01）;母系成员高血压发病年龄有提前的趋势（Ⅱ代62.0±6.2岁;Ⅲ代46.3±5.8岁;Ⅳ代23.3±2.9岁）;母系成员血压与年龄、吸烟、饮酒和高盐饮食有明显相关性（P＜0.05）;母系成员血糖、总胆固醇、血钠明显高于非母系成员（P＜0.05）。分子生物学研究发现在线粒体tRNAIle基因的4263位点发生了A→G点突变,该位点在各个生物都是高度保守的,而且4263位于tRNAIle基因的受体臂5’端,在这个位点发生突变会影响tRNA与氨基酸的结合。为了进一步探讨线粒体tRNAIle4263 A→G点突变影响血压的具体机制,我们对该家系的4个母系成员（3个血压异常和1个血压正常者）和3名遗传背景相同的对照者建立了传代淋巴细胞系,对这些细胞的生长速度及线粒体外膜的VDAC（voltage-dependent anion channel）在携带tRNAIle4263 A→G点突变高血压患者发病中的作用进行了初步研究。结果发现携带A4263G突变者淋巴细胞倍增时间明显延长;VDAC及凋亡相关因子Bax在高血压患者表达增高,而淋巴细胞sKCa通道表达没有明显差异;流式细胞仪检测线粒体膜电势,结果发现与正常对照者比较携带tRNAIle4263 A→G点突变高血压者线粒体膜电势降低,而加入CsA——VDAC拮抗剂后线粒体膜电势升高,与正常者之间的差异消失;共聚焦显微镜检测线粒体外膜的VDAC与Bax蛋白结合的情况,结果发现携带tRNAIle4263 A→G点突变高血压患者线粒体外膜VDAC绿色荧光与Bax蛋白红色荧光融合,而正常对照者两者没有融合,在加入CsA后高血压患者线粒体外膜VDAC绿色荧光与Bax蛋白红色荧光没有融合。为明确VDAC在携带mtDNA突变的高血压患者细胞线粒体钙循环中的作用,我们在对具有母系遗传特点的原发性高血压流行病学调查研究的基础上,对前期发现的携带mtDNA4263A→G突变的原发性高血压大家系患者采集血液样本,通过建立传代的淋巴细胞系,分别加入VDAC抑制剂——CsA和PT（通透性转变孔道）开放剂——苍术苷,利用共聚焦显微镜技术研究VDAC在携带mtDNA突变的高血压患者细胞线粒体钙循环中的作用,结果发现与正常对照者淋巴细胞线粒体内钙荧光强度及△ψm（线粒体膜电势）降低,在加入苍术苷后正常者线粒体内钙荧光强度增加,而突变携带者没有明显改变,但两者△ψm均降低,而加入CsA后可以抑制苍术苷作用。通过此课题研究治疗直接证明了线粒体tRNAIle4263 A→G点突变与高血压发病直接有关,我们的实验也首次从生物进化及分子生物学证据证明:线粒体DNAtRNAIle4263 A→G点突变在具有母系遗传特点的高血压发病中起着重要作用;通过对携带线粒体tRNAIle4263 A→G点突变高血压患者和正常者淋巴细胞建立细胞系,研究发现线粒体外膜的VDAC表达及功能改变可以影响线粒体膜电势（△ψm）、诱导凋亡物质释放及对线粒体内钙([Ca2+]m),因此推测VDAC在线粒体tRNAIle4263 A→G点突变导致血压升高机制中发挥关键作用。