抗CD44抗体A3D8对卵巢癌干/祖细胞增殖和凋亡的影响及其机制研究

论文摘要

目的：探讨抗CD44单克隆抗体A3D8对卵巢癌腹水源和实体瘤源球形体形成细胞增殖、凋亡和周期的影响,并探讨其诱导凋亡的可能作用机制,为治疗卵巢癌提供新的策略。方法：本实验用无血清特殊培法从卵巢癌患者腹水和实体瘤中筛选卵巢癌干/祖细胞,以此种有耐药性的卵巢癌干/祖细胞作为模型。1.用无血清特殊培养法筛选卵巢癌干/祖细胞。用抗CD44单克隆抗体A3D8分别为（0.2、2、6）μg/mL、2.5μg/mL顺铂及联合用药处理后,MTS法测定细胞生长增殖能力；2.AO/EB双重染色法对卵巢癌细胞染色,荧光显微镜下观察不同剂量的A3D8及顺铂对细胞凋亡的影响；3.流式细胞术测定A3D8 2μg/mL作用24h、36h后,卵巢癌腹水源和实体瘤源球形体形成细胞周期分布；4.流式细胞术测定A3D8 2μg/mL对腹水球形体凋亡率的影响；5.用PCR半定量测定A3D8作用前后P21、P27、cyclinD1、cyclinA、CDK2、CDK4、Bcl-2基因表达差异；6. western blot检测A3D8作用前后对CDK2、cyclinA蛋白表达水平的影响。结果：1.A3D8以时间和剂量依赖方式抑制卵巢癌腹水源和实体瘤源球形体形成细胞增殖。2.不同剂量A3D8作用细胞后,AO/EB染色后,荧光显微镜下可看到活细胞核染色质被染成均匀的绿色,早期凋亡细胞被染成桔黄色,晚期凋亡细胞则被染成桔红色或红色,染色质聚集,核染色质呈固缩状或圆珠状,并可见凋亡小体的形成。凋亡率随A3D8剂量增加而增高；与顺铂联用,凋亡率大于单独用药组。3.A3D8 2μg/ml使卵巢癌腹水源和实体瘤源球形体形成细胞周期阻滞在S期,即S期细胞比例增加,G0/G1期比例减少；4.A3D8可以诱导卵巢癌腹水源球形体形成细胞凋亡。与顺铂联用,凋亡率大于单独用顺铂或A3D8组。5.A3D8作用前后,对P21、P27、Bcl-2、cyclinD1、cyclinA、CDK2、CDK4基因表达水平与对照组比较无明显差异；6.A3D8 2μg/ml可明显降低卵巢癌腹水源和实体瘤源球形体形成细胞cyclinA、CDK2蛋白表达水平。结论：A3D8可抑制卵巢癌腹水源和实体瘤源球形体形成细胞增殖,使细胞周期阻滞在S期,诱导细胞凋亡。其机制可能是A3D8使细胞受损伤,CDK/cyclin复合物首先感受到这一信号,使细胞周期阻滞,进而使受损细胞得到修复,如无法修复,细胞即启动凋亡程序,使细胞凋亡。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 符号说明
• 前言
• 研究现状、成果
• 研究目的、方法
• 一、A3D8对卵巢癌腹水源和实体瘤源球形体形成细胞生物学行为影响
• 1.1 对象和方法
• 1.1.1 实验材料
• 1.1.2 实验方法
• 1.2 结果
• 1.2.1 球形体形成细胞形态
• 1.2.2 A3D8对细胞增殖的影响
• 1.2.3 A3D8对细胞周期的影响
• 1.2.4 A3D8诱导细胞凋亡
• 1.3 讨论
• 1.4 小结
• 二、A3D8对卵巢癌细胞周期的影响及相关机制研究
• 实验一:A3D8对细胞周期G1/S期相关调控因子mRNA表达水平的影响
• 2.1 对象和方法
• 2.1.1 实验材料
• 2.1.2 实验方法
• 2.2 结果
• 2.2.1 总RNA提取
• 2.2.2 A3D8对腹水源球形体形成细胞相关周期调控因子mRNA的影响
• 2.2.3 A3D8对实体瘤源球形体形成细胞相关周期调控因子mRNA的影响
• 2.3 讨论
• 2.4 小结
• 实验二:A3D8对CDK2和CyclinA蛋白表达水平的影响
• 3.1 对象和方法
• 3.1.1 实验材料
• 3.1.2 实验方法
• 3.2 结果
• 3.3 讨论
• 3.3.1 A3D8对G1/S期调控因子基因表达的影响
• 3.3.2 A3D8降低S期CDK2、cyclinA蛋白表达
• 3.3.3 A3D8对卵巢癌细胞凋亡的影响
• 3.4 小结
• 结论
• 参考文献
• 发表论文和参加科研情况
• 综述
• 肿瘤干/祖细胞的分子标志及其相关信号传导通路研究进展
• 综述参考文献
• 致谢