bFGF基因修饰的神经干细胞移植对脑出血大鼠的治疗作用

论文摘要

第一部分SPIO标记神经干细胞在脑出血大鼠脑内的显像目的:分离、培养和纯化大鼠成体NSCs。建立稳定的脑出血大鼠模型。利用SPIO标记NSCs。观察SPIO标记后的外源性NSCs在脑出血大鼠脑内的显像。方法:应用NSCs培养液培养并纯化从大鼠胎鼠海马分离得到的细胞,通过有限稀释法验证其具有自我增殖的能力,通过免疫荧光染色标记验证其能否可以分化为神经元和星形胶质细胞。采用尾状核内注射自体动脉全血的方法制作大鼠ICH模型,并在造模24h后对ICH大鼠行磁共振检查和取脑连续切片以验证模型制作效果。通过脂质体介导将SPIO转染到NSCs内,通过普鲁士蓝染色观察转染效果。将SPIO标记的NSCs移植到ICH大鼠侧脑室内4周后,通过MRI观察SPIO标记的NSCs在ICH大鼠内的显像,并通过脑组织切片验证显像效果。结果:可以应用NSCs培养液从大鼠胎鼠海马培养并纯化NSCs,其在体外具有自我增殖的能力,并且可以在分化液存在的情况下分化为神经元和星形胶质细胞。采用尾状核内注射自体动脉全血的方法制作的大鼠ICH模型稳定,可以在大鼠尾状核形成稳定的血肿。SPIO可以通过脂质体介导转染NSCs,并且可以通过MRI观察到标记后的NSCs在ICH大鼠脑内的迁移。结论:可以利用NSCs培养液自大鼠胎鼠海马内分离培养出NSCs。尾状核内注射自体动脉血脑出血模型稳定可靠。SPIO标记NSCs是一种有效的观察移植到ICH大鼠的外源性NSCs迁移的方法。第二部分神经干细胞移植治疗大鼠实验性脑出血目的:观察NSCs移植到脑出血大鼠后的存活、迁徙、分化情况。研究NSCs对脑出血大鼠神经功能损害的可能修复作用。方法:取18只SD雄性大鼠作为研究对象,随机分为三组:A组为空白对照组,B组为移植PBS组,C组为移植NSCs组。通过尾状核内注射自体动脉全血制作大鼠脑出血模型。分离、培养和纯化大鼠胎鼠NSCs并在造模30分钟后移植于C组ICH大鼠血肿周围四点（NSCs移植前经过BrdU标记）,B组大鼠在相应的部位移植PBS,A组大鼠仅造成相应部位的损伤。在移植后4周内不同时间点对各组大鼠施行前肢放置实验和转角实验以检测其神经功能恢复情况。通过脑组织病理切片免疫荧光染色观察NSCs的分化和迁移及其对血肿周围脑组织的影响。结果:从移植第二周末开始,NSCs移植组运动神经功能改善明显优于空白组和PBS组,具有统计学意义（p＜0.05）,而空白组和对照组没有统计学上的差别。免疫荧光染色可以观察到外源性NSCs可以在ICH大鼠脑内存活,迁移和分化,并且观察到移植NSCs组实验大鼠血肿周围细胞凋亡较对照组明显减少。结论:外源性NSCs可以在ICH大鼠血肿周围存活、迁移和分化,并能促进ICH大鼠的神经功能恢复。第三部分含GPP及bFGF基因的慢病毒载体感染神经干细胞目的:转导GFP及bFGF基因到大鼠NSCs内。方法:人工合成大鼠bFGF基因。包装bFGF过表达慢病毒载体并通过其将GFP及bFGF基因转导到NSCs内。通过RtPCR、West-Blot及荧光显微镜下观察的方法检测GFP基因的表达情况。结果:bFGF基因测序正确。RtPCR检测结果提示NSCs感染4天后bFGF基因RNA形成。western-blot检测结果提示NSCs感染后4天和4周均表达bFGF蛋白。通过荧光显微镜可以观察到感染后的NSCs在4周内均表达绿色荧光蛋白。结论:通过bFGF过表达慢病毒载体可以转导GFP及bFGF基因到NSCs内。慢病毒载体感染后的NSCs一月内可以存活并表达bFGF蛋白。第四部分bFGF基因修饰神经干细胞移植对脑出血大鼠的治疗作用目的:观察外源性NSCs或bFGF基因修饰的NSCs移植到ICH大鼠侧脑室后的存活、迁徙、分化情况。研究bFGF基因修饰的NSCs对ICH大鼠神经功能损害的可能治疗作用。方法:分离、培养大鼠胎鼠成体NSCs。通过脂质体介导将SPIO转染到NSCs内。通过慢病毒载体将GFP基因或GFP和bFGF两个基因转导到NSCs内。通过尾状核内注射自体动脉全血制作ICH大鼠模型。取24只SD雄性大鼠作为研究对象,随机分为三组:A组为移植PBS组,B组为移植含GFP基因的NSCs组,C组为移植GFP和bFGF两个基因修饰的NSCs组。在ICH模型造模30分钟后分别移植PBS、GFP基因修饰的NSCs、GFP和bFGF基因修饰的NSCs到A、B、C三组大鼠右侧侧脑室内。在移植后4周内不同时间点,通过前肢放置实验和转角实验功能评分研究各组实验大鼠运动功能恢复情况,通过MRI观察NSCs迁移情况,通过固定后的脑片免疫荧光染色观察各组ICH大鼠脑内NSCs迁移和分化情况,通过Western-Blot分析不同实验组大鼠bFGF表达的差异。结果:移植后4周内,随时间延长各组实验大鼠的运动功能均有不同程度改善。移植后2周及3周后,移植bFGF基因修饰的NSCs组ICH大鼠与其他二组比较,其运动功能改善更显著。移植2周及4周后可以通过磁共振观察到B组和C组移植细胞自实验大鼠侧脑室沿皮质下髓质带迁移到血肿周围。可以通过荧光显微镜观察到移植细胞的迁移路线和在血肿周围的分化。移植bFGF基因修饰NSCs组大鼠的脑室下区和血肿周围新生神经元数量明显较对照组增多。结论:移植bFGF基因修饰的NSCs可能是一种有效的促进外源性和内源性神经再生的方法,从而促进ICH大鼠运动功能的恢复。

论文目录

• 缩略词表
• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 1 脑出血的动物模型
• 2 脑出血的病理生理
• 3 脑出血的治疗方法
• 参考文献
• 第一部分 SPIO标记神经干细胞在脑出血大鼠脑内的显像
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 结论
• 参考文献
• 第二部分 神经干细胞移植对脑出血大鼠的治疗作用
• 前言
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 结论
• 参考文献
• 第三部分 含GFP及bFGF基因的慢病毒载体感染神经干细胞
• 材料
• 方法结果
• 讨论
• 结论
• 参考文献
• 第四部分 bFGF基因修饰的神经干细胞移植对脑出血大鼠的治疗作用
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 结论
• 参考文献
• 全文小结
• 附录
• 文献综述
• 个人小结
• 后记