高增殖性能犬流感重组病毒的制备及流感病毒基因末端序列决定转录水平的研究

论文摘要

犬流感病毒是危害犬类的一类重要病毒,本论文利用流感病毒反向遗传操作技术,拯救了一系列H3N2亚型犬流感病毒株A/canine/Zhejiang/01/2010（H3N2）（简称ZJCIV）和PR8（A/Puerto Rico/8/34（H1N1））的重组病毒,筛选获得了一株高效表达H3N2亚型犬流感病毒表面抗原的重组病毒；利用PR8病毒微型复制子系统,研究了包装效率最高的情况下,流感病毒8个基因片段末端序列对报告基因（Firefly luciferase）转录的影响,同时比较研究了不同包装效率下,M基因末端序列对报告基因转录的影响。近年来爆发的H3N2亚型犬流感对我国不同种类的犬构成极大威胁,目前还没有有效的疫苗用于该病毒防制。ZJCIV在鸡胚和MDCK细胞上的增殖能力均很差,为了获得高效表达ZJCIV病毒表面抗原的重组病毒,本实验利用反向遗传操作技术,将ZJCIV的HA和NA基因与PR8病毒的内部基因及突变的NP （G132A）基因和NS2（E67/74S）进行人工重组,拯救并获得了4株犬流感重组病毒CIV-PR8、CIV-NP、 CIV-NS和CIV-NP-NS。用含100EID50的病毒接种9-11日龄SPF鸡胚。CIV-NS,CIV-NP-NS接种鸡胚36h后,尿囊液的HA滴度达到最高,CIV-NP和CIV-PR8在接种48h后尿囊液的HA滴度达到最高,CIV-NS的血凝效价平均值可达213.33。用2×103TCID50的病毒感染MDCK细胞,CIV-NS的细胞上清HA滴度最高,可达210,CIV-NP-NS次之为29,而野生病毒ZJCIV只有24；无论通过鸡胚扩增还是细胞扩增,4株重组犬流感病毒的TCID50均高于ZJCIV,其中CIV-NS的TCID50高于其他毒株。本研究我们成功救获了4株增殖能力明显高于野生毒株ZJCIV重组犬流感病毒,CIV-NS在鸡胚和MDCK细胞上的增殖能力明显优于其他毒株,该重组病毒有望成为犬流感疫苗研制的候选种毒。流感病毒基因片段的3’端和5’端非编码区及部分编码区序列不仅起包装信号的作用,而且这些序列决定了流感病毒各基因的表达量。本研究将PR8流感病毒株最高包装效率的8个基因片段5’和3’末端序列分别克隆于RNA聚合酶Ⅰ启动子和RNA聚合酶Ⅰ终止子之间,并且在5’和3’端之间设计酶切位点,然后在酶切位点之间插入报告基因（Firefly luciferase）,并将5’端编码区的起始密码子ATG突变为GTG,改造后的基因只转录表达报基因的开放阅读框。将构建的质粒分别与表达流感病毒PB1、PB2、PA、NP及表达内参Renilla luciferase的5个表达质粒共转染293T细胞,利用双荧光素酶报告基因系统比较在包装效率最高的情况下,流感病毒8个基因片段末端序列对报告基因（Firefly luciferase）转录的影响。研究发现,PA基因末端的转录水平最高,而M基因末端的最低。选择了M基因片段的5种包装效率下的末端序列,用同样的方法构建重组质粒,将构建的质粒分别与表达流感病毒PB1、PB2、PA、NP及表达内参Renilla luciferase的5个表达质粒共转染293T细胞,利用双荧光素酶报告基因系统比较在包装效率不同的情况下,流感病毒M基因片段末端序列对报告基因（Firefly luciferase）转录的影响。结果发现vRNA （?）勺5’端为220个核苷酸和3’端0个核苷酸的转录水平最高。以上研究为构建高效表达流感病毒基因和外源基因的流感病毒载体奠定了基础。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 引言
• 1.1 流感病毒（Influenza virus,Ⅳ）的概述
• 1.2 流感病毒的形态结构
• 1.3 流感病毒的理化性质
• 1.4 流感病毒毒株的命名
• 1.5 流感病毒的复制与变异机制
• 1.6 流感病毒的基因和编码的蛋白
• 1.6.1 血凝素（Hemagglutinin,HA）
• 1.6.2 神经氨酸酶（Neuraminidase,NA）
• 1.6.3 基质蛋白（Matrix Protein,M）
• 1.6.4 聚合酶蛋白（Polymerase）
• 1.6.5 核蛋白（Nucleoprotein,NP）
• 1.6.6 非结构蛋白（Nonstructural Protein）NS1和NS2
• 1.7 A型流感的反向遗传操作系统
• 1.8 流感病毒的疫苗研究
• 1.9 犬流感概述
• 1.10 犬流感疫苗的研究
• 1.11 流感病毒的包装机制
• 1.12 流感病毒包装信号的简介
• 1.13 流感病毒的转录
• 1.14 本研究的目的与意义
• 2 重组H3N2 亚型犬流感病毒的拯救及其生长特性研究
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 材料
• 2.1.2 方法
• 2.2 结果
• 2.2.1 ZJCIV犬流感病毒的HA和NA基因的RT-PCR鉴定
• 2.2.2 ZJCIV的HA,NA及pBD载体的酶切鉴定
• 2.2.3 重组质粒pBD-CIV-HA,pBD-CIV-NA的鉴定
• 2.2.4 救获重组病毒CIV-PR8,CIV-NP,CIV-NP-NS,CIV-NS的鉴定
• 2.2.5 四株重组病毒的EID50和TCID50测定结果
• 2.2.6 四株重组病毒在鸡胚上生长特性比较结果
• 2.2.7 四株重组病毒在MDCK细胞上生长特性的比较结果
• 2.3 讨论
• 3 流感病毒不同基因末端序列对报告基因转录水平的影响
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 材料
• 3.1.2 方法
• 3.2 结果
• 3.2.1 重组质粒pUC19-HA-Firefly构建的结果
• 3.2.2 重组质粒pUC19-PA-Firefly构建的结果
• 3.2.3 重组质粒pUC19-NP-Firefly构建的结果
• 3.2.4 重组质粒pUC19-NS-Firefly构建的结果
• 3.2.5 重组质粒pUC19-M-Firefly构建的结果
• 3.2.6 重组质粒pUC19-PB1-Firefly构建的结果
• 3.2.7 重组质粒pUC19-PB2-Firefly构建的结果
• 3.2.8 各片段包装效率最高时的末端序列表达质粒的转录水平比较
• 3.3 讨论
• 4 M基因末端序列对报告基因转录水平的影响
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 材料
• 4.1.2 方法
• 4.2 结果
• 4.2.1 pUC19-0-M- 0- Firefly的鉴定结果
• 4.2.2 pUC19-111-M- 220- Firefly的鉴定结果
• 4.2.3 pUC19-0-M-220-Firefly的鉴定结果
• 4.2.4 pUC19-222-M-0-Firefly的鉴定结果
• 4.2.5 pUC19-222-M- 111- Firefly的鉴定结果
• 4.2.6 M基因6个不同包装效率的末端序列的转录水平比较
• 4.3 讨论
• 5 全文结论
• 致谢
• 参考文献
• 作者简介