一维微流控微珠阵列芯片在核酸和蛋白激酶分析中的应用

论文摘要

一维微流控微珠阵列芯片作为一个新型的微量多元分析平台,有机地结合了微流控技术、微阵列芯片技术以及微珠非均相识别技术。该平台设计灵活、操作简单、试剂消耗量少并可在单一微通道内实现高通量的生物样品并行分析,在生物微分离分析方面具有非常广阔的应用前景。为了进一步开发和拓展一维微流控微珠阵列芯片的应用,使其发展成为一种通用的生物检测平台,本文以核酸和蛋白激酶为检测对象,以发展高灵敏、操作简单、低成本的检测方法为研究主线,主要开展了以下三方面的工作:（1）基于阳离子型荧光聚噻吩的一维微流控微珠阵列多基因表达检测将阳离子型荧光聚噻吩引入一维微流控微珠阵列检测平台用于核酸的荧光检测。首先考察了对p53 cDNA的检测性能,在此基础上实现了混合DNA样品中多目标分子的同时分析,并进一步检测了抗癌药物刺激前后的CNE2细胞系中肿瘤相关基因p53、c-myc和cyclin-d1的mRNA表达差异。该方法整合了一维微流控微珠阵列和荧光聚合物两者的优势,无需探针和目标的标记,具有简单直接、成本低、灵敏度高等优点。（2）基于一维微流控微珠阵列芯片和抗体识别磷酸化的蛋白激酶检测首先将底物肽固定于微珠表面,通过对各种实验条件的考察和优化,在一维微流控微珠阵列上实现了蛋白激酶A的检测,其线性范围为5-100 nM。此外还考察了抑制剂药物H-89对蛋白激酶A的抑制效果。该方法成功将一维微流控微珠阵列平台的应用拓展至酶活性分析领域,为使一维微流控微珠阵列芯片发展成为通用型的检测平台迈出了非常重要的一步。（3）酶催化生物素共转移用于一维微流控微珠阵列芯片的蛋白激酶分析针对抗体识别磷酸化技术在多种蛋白激酶同时分析中存在成本高和操作复杂的缺陷,本实验利用生物素化的ATP作为共底物,使蛋白激酶催化磷酸基团转移的同时共转移生物素,以检测生物素转移的量达到间接检测蛋白激酶活性的目的。通过此方法分别检测了蛋白激酶A和Abl蛋白激酶的活性,其检测下限为35 U/ml和15 U/ml,随后在芯片内实现了这两种激酶的同时检测和多种抑制药物的筛选。比较传统方法,该方法更具通用性,体现了一维微流控微珠阵列在蛋白激酶活性分析和药物筛选方面的优势。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第1章 绪论
• 1.1 核酸分析的重要性及研究进展
• 1.2 蛋白激酶及其经典分析方法
• 1.2.1 蛋白激酶概述
• 1.2.2 蛋白激酶经典分析方法
• 1.3 微芯片技术在核酸和蛋白激酶分析中的应用
• 1.3.1 微阵列芯片在核酸和蛋白激酶分析中的应用
• 1.3.2 微流控芯片在核酸和蛋白激酶分析中的应用
• 1.3.3 微珠技术在核酸和蛋白激酶分析中的应用
• 1.4 一维微流控微珠阵列芯片的发展
• 1.5 本文拟开展的研究工作
• 第2章 基于阳离子型荧光聚噻吩的一维微流控微珠阵列多基因表达检测
• 2.1 前言
• 2.2 实验部分
• 2.2.1 仪器和试剂
• 2.2.2 实验方法
• 2.3 结果与讨论
• 2.3.1 实验原理
• 2.3.2 阳离子型聚噻吩的荧光特性
• 2.3.3 均相溶液中阳离子聚噻吩的核酸检测能力考察
• 2.3.4 一维微流控微珠阵列芯片用于cDNA 的检测
• 2.3.5 一维微流控微珠阵列用于多基因转录水平的表达分析
• 2.3.6 RT-PCR 对分析结果的验证
• 2.4 小结
• 第3章 基于一维微流控微珠阵列芯片和抗体识别磷酸化的蛋白激酶检测
• 3.1 前言
• 3.2 实验部分
• 3.2.1 试剂和仪器
• 3.2.2 实验方法
• 3.3 结果与讨论
• 3.3.1 实验原理
• 3.3.2 两种微珠性能的比较
• 3.3.3 反应体系内各物质浓度的优化
• 3.3.4 检测条件的考察
• 3.3.5 芯片内蛋白激酶A 的检测
• 3.3.6 H-89 对蛋白激酶A 活性的影响
• 3.4 小结
• 第4章 酶催化生物素共转移用于一维微流控微珠阵列芯片的蛋白激酶分析
• 4.1 前言
• 4.2 实验部分
• 4.2.1 试剂和仪器
• 4.2.2 实验方法
• 4.3 结果与讨论
• 4.3.1 实验原理
• 4.3.2 芯片内蛋白激酶检测的灵敏度和响应范围
• 4.3.3 芯片内多种蛋白激酶的同时检测
• 4.3.4 多种药物抑制效果的平行分析
• 4.3.5 对特异蛋白激酶的抑制评价
• 4.4 小结
• 结论
• 参考文献
• 附录 攻读学位期间所发表的学术论文目录
• 致谢