山羊生长激素基因乳腺特异性基因打靶载体的构建及阳性细胞株的筛选

论文摘要

研究表明生长激素（growth hormone, GH）可作用于乳腺间质细胞的GH受体,诱导细胞产生胰岛素样生长因子-1（insulin-like growth factor1, IGF-1）刺激乳腺腺泡的发育和增加乳腺血流量,达到维持泌乳和提高奶产量的作用。本研究首先利用基因打靶技术将山羊GH基因定点导入山羊β-酪蛋白基因座中,构建乳腺特异性基因打靶载体pLG,然后在细胞和乳腺组织中进行功能验证。最后将pLG转染山羊耳皮成纤维细胞进行筛选,为今后培育转GH山羊奠定试验基础。本研究中主要试验内容分为以下三部分：1.山羊β-酪蛋白基因5’和3’调控元件克隆及功能验证本试验的目的是扩增山羊β-酪蛋白的3’和5’调控元件,构建乳腺特异性打靶载体pGFP,通过绿色荧光蛋白（GFP）的表达验证β-酪蛋白基因调控元件的功能。首先从新鲜采集的肝素抗凝山羊血中提取山羊基因组DNA, PCR扩增其3’和5’调控元件进行测序并分别双酶切插入打靶载体pLOXP II的SalⅠ/ClaⅠ与NotⅠ/XhoⅠ多克隆位点,得到的载体命名为pL5。然后将GFP序列通过Xho Ⅰ单酶切插入pL5载体的Xho Ⅰ多克隆位点,得到的载体命名为pGFP.将载体pGFP通过脂质体法转染Bcap-37细胞,6小时后换液去除脂质体并加入10%胎牛血清,转染后36小时在荧光显微镜观察。测序结果表明PCR扩增得到的山羊β-酪蛋白基因的3’和5’端调控元件序列,与GenBank中公布的相应序列同源性在99.5%以上,可以作为基因打靶载体的两侧同源臂使用。pGFP质粒转染组细胞荧光强度显著高于对照组,证明克隆的山羊β-酪蛋白基因3’与5’调控元件具有在细胞水平指导外源基因表达的生物学活性。2.山羊GH基因乳腺特异性打靶载体pLG的构建及其生物学功能验证将GH cDNA酶切插入pLG载体Xho Ⅰ多克隆位点,得到GH基因乳腺特异性打靶载体并将其命名为pLG。构建的乳腺特异性基因打靶载体pLG质粒采用脂质体法,分别导入人乳腺癌细胞Bcap-37和泌乳期山羊乳腺,转染后提取细胞裂解液和乳腺组织,采用RT-PCR和ELISA方法检测GH转录和表达水平。结果显示与空白组相比,转染pLG质粒组在细胞（P<0.01）和乳腺组织中（P<0.05）GH转录水平和蛋白表达量均显著提高,表明载体pLG可在乳腺细胞上和乳腺组织中成功转录和表达GH。试验结果显示构建的山羊GH基因乳腺特异性打靶载体可以应用到后续的转GH基因奶山羊生产研究中。3.山羊GH基因乳腺特异性打靶载体pLG转染山羊胎儿成纤维细胞和细胞筛选将pLG质粒通过脂质体法转染山羊胎儿成纤维细胞,转染后36h加入G418（600ng/mL）进行正筛选,10d后山羊胎儿成纤维细胞出现明显单克隆集落。将G418浓度降至300ng/mL并加入丙氧鸟苷（4umoL/mL）负筛选,7d后挑取单克隆集落消化传代至48孔细胞培养板进行连续扩培,扩培至6孔板后提取单克隆基因组DNA并冻存细胞。试验结果表明共筛选到36个单克隆细胞株,PCR检测结果显示其中有5个单克隆细胞株正确整合。

论文目录

• 目录
• 引言
• 摘要
• ABSTRACT
• 第一篇 文献综述
• 第一章 GH在转基因动物研究中的应用
• 1 山羊GH的研究进展
• 1.1 GH的分布与其在山羊乳腺血浆中的含量变化
• 1.2 GH的生物学功能分析
• 2 GH转基因动物的研究进展
• 2.1 GH与转基因动物
• 2.2 转GH基因山羊的生物安全性分析
• 2.3 小结
• 参考文献
• 第二章 乳腺基因打靶载体的研究进展
• 1 基因打靶载体的基础理论
• 1.1 基因打靶技术的原理和方法
• 1.2 影响基因打靶效率的因素
• 1.3 基因打靶技术的安全性研究进展
• 2 乳腺基因打靶技术
• 2.1 乳蛋白基因位点
• 2.2 启动子和增强子
• 2.3 非翻译区
• 3 乳腺体细胞基因打靶核移植技术在家畜转基因研究中的应用
• 3.1 胚胎干细胞基因打靶技术
• 3.2 体细胞基因打靶核移植技术
• 3.3 乳腺体细胞基因打靶核移植技术的应用前景与存在的问题
• 参考文献
• 第二篇 试验研究
• 第三章 山羊β-酪蛋白基因5’和3’调控元件克隆及功能验证
• 摘要
• 1 材料和方法
• 1.1 材料和仪器
• 1.2 试验方法
• 2 结果与分析
• 2.1 山羊基因组DNA的提取
• 2.2 β -酪蛋白5’端调控元件的克隆
• 2.3 β-酪蛋白3’端调控元件的克隆
• 2.4 GFP基因cDNA的克隆
• 2.5 基因打靶载体pGFP的构建和酶切验证
• 2.6 pGFP质粒瞬时转染Bcap-37细胞检测GFP的表达
• 3 讨论
• 参考文献
• 第四章 山羊GH基因乳腺特异性打靶载体pLG的构建及其生物学功能验证
• 摘要
• 1 材料和方法
• 1.1 材料和仪器
• 1.2 试验方法
• 2 结果与分析
• 2.1 山羊GH基因乳腺特异性打靶载体pLG的构建
• 2.2 基因打靶载体pLG表达效率的验证
• 3 讨论
• 参考文献
• 第五章 山羊GH基因乳腺特异性打靶载体pLG转染山羊耳皮成纤维细胞和细胞筛选
• 摘要
• 1 材料和方法
• 1.1 材料和仪器
• 1.2 试验方法
• 2 结果与分析
• 2.1 山羊耳皮成纤维细胞G418梯度抗性试验
• 2.2 基因打靶载体pLG转染山羊耳皮成纤维细胞与细胞筛选
• 2.3 单克隆细胞的PCR验证
• 3 讨论
• 参考文献
• 全文总结
• 攻读学位期间发表的文章、发明专利及奖项
• 致谢