论文题目: 几种蔬菜ACC氧化酶基因的克隆与鉴定
论文类型: 博士论文
论文专业: 蔬菜学
作者: 陈银华
导师: 叶志彪
关键词: 番茄,黄瓜,花椰菜,遗传转化,氧化酶,基因克隆,基因表达,干涉
文献来源: 华中农业大学
发表年度: 2005
论文摘要: 乙烯作为一种植物激素,对植物种子萌发、生长发育、衰老、果实成熟、性别分化等有广泛的影响,同时与逆境胁迫如机械伤害、冷害、渍水、病原菌入侵等方面有关;并参与植物细胞的程序性死亡。植物体内乙烯的生成量主要由ACC合成酶(ACS)和ACC氧化酶(ACO)的活性大小决定,而这两个关键酶活性的提高是其mRNA表达的结果。利用基因工程克隆植物乙烯ACS和ACO基因,通过反馈调节、反义表达等调控乙烯合成,进而调控乙烯对植物的生理效应,是当前对乙烯研究的主要途径。国内有关实验已在番茄等一些跃变型果实中获得成功。研究乙烯合成酶基因和氧化酶基因的克隆、表达及调控机理,对全面了解乙烯对植物的生理效应及化控机理具有重要的指导意义。 本研究的目的:克隆番茄、黄瓜、花椰菜等3种蔬菜作物的ACC氧化酶基因,对其结构进行分析;克隆ACC氧化酶基因的启动子,研究ACO基因的表达规律,为从分子水平上调控该基因的表达打下基础。最后,构建正义、反义、RNAi植物表达载体,调控ACC氧化酶基因的表达。结果如下: 1.克隆了番茄ACO基因LeACO11基因组序列(gDNA)及相应的cDNA序列。测序结果分析表明:该基因gDNA序列长1697bp,由4个外显子、3个内含子组成。相应的cDNA序列长1018bp。生物信息学工具软件分析,预计该基因CDS全长951bp,编码316个氨基酸。RT-PCR结果与预测的CDS一致。gDNA序列与cDNA序列比对发现,内含子与外显子交替的位置总是以AG碱基出现,并被剪切。对该基因cDNA推断的蛋白质进行同源性分析,与番茄ACO3(CAA90904)的同源性为85%,ACO1(CAA41212)的同源性为82%。 2.利用载体介导的PCR方法克隆了LeACO基因的上游调控序列2000bp。测序结果分析表明,2000bp的片段含有起始密码子上游1946bp,+97～+99位为翻译起始密码子,(-29～-22)之间为TATA盒(TATAAATA),(-193～-189)为CAAT盒(CCAAT),-1724～-1300与-1037～-592高度重复,存在100多个转录因子结合位点。 3.对番茄植株不同组织及不同发育时期的器官(茎、叶片、花、果实的未成熟期、绿熟期、破色期、红熟期)ACO基因的表达分析发现,LeACO11基因在叶片中有微量表达,在未成熟期果实中没有表达,在绿熟期、破色期、红熟期果实中均有高水平的表达,且随成熟度的增加其表达量增强。推断该基因的表达具有时间和空间特异性。
论文目录:
摘要
ABSTRACT
缩略词表
第一章 前言
1 课题的提出
2 前人研究工作
2.1 乙烯的生物合成及其影响因素
2.2 乙烯的生理作用
2.3 调控乙烯的研究进展
2.4 RNAi研究进展
3 本研究的目的及内容
第二章 番茄ACC氧化酶基因的克隆与鉴定
1 前言
2 材料与方法
2.1 植物材料、菌株、质粒、试剂
2.2 LeACOll基因的克隆
2.3 LeACOll基因的表达分析
2.4 LeACOll基因上游启动子的克隆
2.5 LeACOll基因植物表达载体构建
2.6 番茄的遗传转化
2.7 转基因番茄植株的分子检测
2.8 LeACOll基因启动子序列鉴定与分析
3 结果与分析
3.1 LeACOll基因的克隆及序列分析
3.2 LeACOll基因上游启动子的克隆及分析
3.3 LeACOll基因在番茄不同组织中的表达分析
3.4 LeACOll基因植物表达载体的构建
3.5 转基因番茄植株的获得
3.6 转基因番茄植株的分子鉴定
3.5 上游启动子区调控元件分析
3.6 转基因植株叶片乙烯生成速率分析
3.7 转基因植株后代的遗传分析
4 讨论
4.1 三种载体在内源抑制上的不同
4.2 遗传转化上的难题
4.3 上游调控序列的克隆方法
4.4 启动子元件
第三章 黄瓜ACC氧化酶基因的克隆及鉴定
1 前言
2 材料与方法
2.1 植物材料
2.2 黄瓜总DNA的提取
2.3 黄瓜ACO基因及上游序列的PCR扩增
2.4 序列分析
2.5 Southern杂交分析
2.6 RT-PCR及Northern杂交分析
2.7 RNAi载体构建
2.8 黄瓜的遗传转化
2.9 转基因黄瓜植株的分子杂交
2.10 RNAi转基因黄瓜植株的形态观察
3 结果与分析
3.1 黄瓜ACO基因及其上游序列的获得
3.2 黄瓜CsACO4基因的序列分析
3.3 CsACO基因推断的氨基酸序列的系统进化分析
3.4 CsACO4基因在黄瓜基因组中的分布
3.5 CsACO4基因表达分析
3.6 CsACO4基因RNAi载体的构建
3.7 转基因黄瓜植株的获得
3.8 转基因黄瓜植株的分子检测
3.9 转基因材料的表型观察
4 讨论
4.1 同源序列克隆
4.2 上游序列的表达调控
4.3 ACC氧化酶与黄瓜性别分化的关系
4.4 黄瓜遗传转化的难点及如何提高阳性率
第四章 花椰菜ACC氧化酶基因的克隆及遗传转化
1 前言
1.1 问题的提出
1.2 前人研究进展
1.3 研究的内容
2 材料与方法
2.1 材料
2.2 花椰菜ACO基因的克隆
2.3 序列测定及同源性分析
2.4 BoACO基因表达检测
2.5 BoACO基因RNAi载体的构建
2.6 花椰菜下胚轴的遗传转化
2.7 转基因花椰菜植株的分子检测
2.8 转基因花椰菜植株叶片ACC氧化酶活性的测定
3 结果与分析
3.1 ACO基因的克隆及序列分析
3.2 BoACO的组织特异性分析
3.3 BoACO基因的RNA干涉载体构建
3.4 转基因花椰菜植株的获得
3.5 转基因花椰菜植株的分子检测
3.6 转基因花椰菜植株的ACC氧化酶活性分析
4 讨论
4.1 RNAi对内源基因的抑制
4.2 花椰菜的遗传转化
第五章 3种蔬菜ACC氧化酶基因之间的比较
参考文献
附录
致谢
发布时间: 2005-12-05
参考文献
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