文蛤活性多肽对肝癌细胞SMMC-7721效应的差异蛋白质组研究

论文摘要

文蛤（学名:Meretrix Meretrix Linnaeus ,英文名:Hard clam）不仅肉质鲜美、营养丰富,而且具有很高的药用价值。据报道文蛤具有抗癌、降血糖、降血脂和抗氧化等活性。许多研究者已对文蛤抗癌活性做了研究,证实文蛤提取物具有较强的抗癌活性。将文蛤肉匀浆、抽提,并通过G-25凝胶层析柱分离,得到具有抑癌活性的组分,初步判断为肽类物质。该组分在浓度为0.5μg/mL时对肝癌细胞SMMC-7721的抑制率能达到50.6%。通过光学显微镜观察,可以发现肝癌细胞在文蛤提取物作用后形态发生很大变化。利用蛋白质组学手段研究文蛤活性多肽对肝癌细胞的作用有助于更好地研究该物质抑制肝癌细胞的机制,为后续的研究提供理论基础。通过双向电泳技术的建立以及初步优化对一些环节如样品处理的方法、上样量的选择、电泳参数的设置、凝胶浓度和SDS凝胶电泳染色方法等进行了优化得到了分辨率较好的肝癌细胞SMMC-7721的蛋白图谱。进一步通过2D软件分析图谱,确定差异点。进行胶内酶解并对酶解条件进行了优化。利用MALDI-TOF质谱仪进行质谱分析。最后利用质谱数据在网上进行检索鉴定差异蛋白质。通过图谱分析找到136个差异蛋白其中96个蛋白表达下调,40个蛋白表达上调。对其中差异较明显的点进行了鉴定,最终鉴定出10种差异蛋白。其中6个蛋白表达下调,3个蛋白表达上调。另有一个蛋白等电点发生了变化。这些差异蛋白中有分子伴侣蛋白、细胞骨架蛋白、锌指蛋白、代谢相关蛋白、调控蛋白等。可见细胞从骨架到代谢都发生了变化。我们对差异点的功能进行了探讨,并提出了文蛤活性物质抑制细胞的可能途径。该论文为课题组以后进一步研究文蛤活性多肽抑癌作用的机理提供了理论参考。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 1 前言
• 1.1 文蛤简介
• 1.2 文蛤活性物质的研究
• 1.2.1 免疫活性
• 1.2.2 文蛤提取物降糖、降血脂、抗氧化活性
• 1.2.3 文蛤提取物抗癌活性研究
• 1.3 蛋白质组起源
• 1.4 蛋白质组的研究策略
• 1.5 蛋白组相关技术
• 1.5.1 蛋白质分离技术
• 1.5.1.1 样品制备
• 1.5.1.2 IEF 等电聚焦（isoelectricfocusing,IEF）
• 1.5.1.3 SDS-PAGE 电泳
• 1.5.1.4 电泳显影技术
• 1.5.2 2–DE分析软件
• 1.5.3 质谱技术
• 1.5.4 生物信息学
• 1.5.5 其它技术
• 1.6 蛋白质组与肝癌
• 1.6.1 肝癌概述
• 1.6.2 蛋白质组在肝癌研究中的应用
• 1.7 论文研究内容及意义
• 2 材料与仪器
• 2.1 材料
• 2.2 试剂
• 2.3 仪器
• 2.4 试剂配制
• 3 实验方法
• 3.1 抗癌多肽的初步分离
• 3.2 细胞培养和文蛤多肽的处理
• 3.3 形态结构观察
• 3.4 样品处理
• 3.5 第一向等电聚焦胶电泳（IEF）
• 3.6 第二向SDS-PAGE 电泳
• 3.7 银染色
• 3.8 考马斯亮蓝G-250 染色
• 3.9 扫描和图象处理
• 3.10 蛋白质胶内酶切1
• 3.11 蛋白质胶内酶切2
• 3.12 质谱结果检索
• 4 结果
• 4.1 文蛤抗癌多肽的初步纯化
• 4.2 细胞形态观察
• 4.3 双向电泳条件的建立
• 4.3.1 样品的制备
• 4.3.2 等电聚焦
• 4.3.3 银染条件
• 4.3.4 第二向SDS-PAGE
• 4.3.5 胶内酶解方案的优化
• 4.4 肝癌差异蛋白分析
• 4.5 差异点质谱分析结果
• 5 讨论
• 5.1 文蛤抗癌多肽对肝癌细胞 SMMC-7721 的抑制作用
• 5.2 抗癌多肽作用肝癌细胞 SMMC-7721 后蛋白的差异表达分析
• 5.3 多肽作用机制的推测
• 5.3.1 未折叠蛋白反应（UPR）诱导的细胞凋亡
• 5.3.2 β 微管蛋白的修饰作用
• 6 参考文献
• 7 致谢
• 8 发表论文