论文摘要
前言肝细胞癌（Hepatocellular carcinoma,HCC）是对人类健康和生命威胁较大的恶性肿瘤之一。尽管已知HCC与乙肝病毒感染、黄曲霉等因素有关。但仅有小部分暴露于这些危险因素的人发生肝癌。究其原因可能与人群或个体的肿瘤易感性有关,即不同人群或个体对致癌物致癌的易患性不同。遗传易感性主要的决定因素是基因的差异,与肿瘤相关的基因主要包括DNA修复基因和代谢酶基因。这些基因均存在着单核苷酸多态（Single Nucleotide Polymorphism,SNP）,它们的产物往往具有不同的生物学活性,从而表现为机体对同一致癌物的易感性不同。DNA修复系统是机体内主要的防御屏障,参与修复由内外环境因素所致的DNA损伤。DNA修复能力缺陷或低下将增加基因突变和细胞癌变的危险。因此,DNA修复能力低于一般人群平均水平的个体对肿瘤易感。XPD和XRCC1是两种重要的DNA修复基因,参与DNA的碱基切除修复和核苷酸切除修复。这两种基因多个位点存在单核苷酸多态现象,并且与肺癌、胃癌、乳腺癌等各种肿瘤的易感性相关。但它们与原发性肝癌易感性关系的研究报告尚少。本研究通过病例对照研究,采用聚合酶链反应一限制性片段长度多态性（Poylmeares Chain Reaction Resrtiction Fragment Length Poylmorphism,PCR-RFLP）的方法,检测XPD基因Lys751Gln和XRCC1基因Arg194Trp、Arg280His、Arg399Gln等常见位点的基因型多态性,探讨上述基因位点单核苷酸多态性与肝癌遗传易感性的相关性。研究重点是单基因多态与肝癌易感性的关系和基因多态性和肝炎病毒感染在肝癌易感性中的交互作用。为肝癌高危人群的确立提供依据。材料和方法本研究采用病例对照研究方法,包括原发性肝癌100例,正常对照111例,均为辽宁省人。病例为中国医科大学附属第一医院介入科辽宁省肿瘤医院住院治疗患者,所有患者均按照2001年9月第八届全国肝癌学术会议通过的原发性肝癌临床诊断标准诊断为原发性肝癌,并且选择病理诊断为肝细胞癌的病例或AFP增高的病例为研究对象。所有患者采血前均未进行过化放疗。对照组选自同一医院体检中心进行健康体检的人群,体检结果正常,无肿瘤病史及遗传病史。正常对照按年龄5岁和性别与病例频数按1:1匹配。在收集血液标本的同时,收集每个研究对象的人口学资料及相关危险因素资料。采用聚合酶链反应一限制性片段长度多态性（Poylmeares Chain ReactionResrtiction Fragment Length Poylmorphism,PCR-RFLP）的方法,检测XPD基Lys751Gln多态基因型和XRCC1基因Arg194Trp、Arg280His和Arg399Gln多态基因型。采用碘化钾法从抗凝血中提取基因DNA。PCR扩增XPD-751、XRCC1-194、XRCC1-280和XRCC1-399多态。各基因设计引物如下:XPD 751:5′-GCCCGCTCTGGATTATACG-3′和5′-CTATCATCTCCTGGCCCCC-3′;XRCC1-194:5’GCC AGG GCC CCT CCT TCA A 3’和5’TAC CCT CAG ACC CAC GAG T 3’;XRCC1-399:5’TTG TGC TTT CTC TGT GTC CA 3’和5’TCC TCC AGC CTT TTCTGA TA 3’:XRCC1-280:5’CCA GTG GTG CTA ACC TAA TC3’和5’CAC TCA GCACCA CTA CCA CA3’。PCR反应条件:XPD-751、RCC1-194和XRCC1-399反就条件为94℃预变性2min,然后94℃30秒、57℃30秒、72℃45秒,30个循环后72℃终延伸7min。XRCC1 280将30个循环中的57℃改为59℃,其余条件同上。电泳分析PCR产物。对PCR产物进行酶切,各基因对应的内切酶分别是XPD-751为PstⅠ,XRCC1-280为RsaⅠ,XRCC1-399为MspⅠ、XRCC1-194为PvuⅡ。取PCR产物5μl与相应的限制性核酸内切酶于37水浴过夜,用1.5%琼脂糖凝胶电泳分析酶切产物。以X2检验比较XPD751、XRCC1-194 XRCC1-280 XRCC1-399多态基因型及相关危险在病例与对照之间分布的差异。采用Logistic态基因型与肝癌发生危险度的关系及其与暴露危险因素的交互作用。所用统计软件为SPSS12.0.结果1.肝癌患者XPD751基因Lys/Lys,Lys/Gln,Gln/Gln多态基因型频率分别为76（76.00%）,23（23.00%）和1（1.00%）,而健康对照组分别为88.28%、9.91%和1.8%;两组间比较有非常显著的差异（p=0.033）2.经Logistic回归分析发现携带至少1个751Gln等位基因（Lys/Gln和Gln/Gln基因型）的个体患肝癌的危险显著增高（OR=2.38,95%CI为1.14-4.98,p=0.019）。3.XPD751基因Lys/Gln,Gln/G1n基因型与乙型肝炎病毒感染存在交互作用。携带至少1个751Gln等位基因且有肝炎感染者患肝癌的危险度是不携带Gln基因并且无乙型肝炎病毒感染者的123.75倍,（95%CI为15.56-984.00）。4.肝癌患者XRCC1-194多态基因型Arg/Arg、Arg/Trp、Trp/Trp频率分别为46.00%、50.00%和4.00%,而健康对照组分别为51.35%、、38.74%和9.91%;两组间比较无统计学差异（p=0.110）5.经Logistic回归分析发现携带Arg/Trp和Trp/Trp基因型者较携带Arg/Arg基因型者无明显增加患肝癌的风险性。（OR=1.24;95%CI为0.71-2.13,p=0.437）。6.肝癌患者XRCC1-280基因Arg/Arg、Arg/His、His/His多态基因型频率分别为79.00%、20.00%和1.00%而健康对照组分别为78.38%,18.92%和2.7%,两组间比较无统计学差异（p=0.912）7.经Logistic回归分析发现携带Arg/His和His/His基因型者较携带Arg/Arg基因型者无明显增加患肝癌的风险性。（OR=0.096;95%CI为0.50-1.86,p=0.912）。8.肝癌患者XRCC1-399基因Arg/Arg、Arg/Gln、Gln/Gln多态基因型频率分别为40.00%、53.00%和7.00%而健康对照组分别为62.16%,27.93%和9.91%,两组间比较有非常显著的差异（p=0.001）9.经Logistic回归分析发现携带Arg/Gln和Gln/G1n基因型者较携带Arg/Arg基因型者明显增加患肝癌的风险性（OR=2.64,95%CI 1.46-4.80,P=0.001）,。10.XRCC1399基因Arg/Gln,Gln/Gln基因型与乙型肝炎病毒感染存在交互作用。携带至少1个399Gln等位基因且有肝炎感染者患肝癌的危险度是不携带Gln基因并且无乙型肝炎病毒感染者的170.76倍,（95%CI为40.02-717.03）。结论1.XPD基因Lys751Gln多态性是肝癌的遗传易感因素,751Gln基因是肝癌的风险基因。2.XPD基因Lys751Gln多态性与肝癌暴露危险因素在肝癌的发生中存在交互作用。3.XRCC1基因Arg399Gln多态性是肝癌的遗传易感因素,399Gln是肝癌的风险基因。4.XRCC1基因Arg399Gln多态性与肝癌暴露危险因素在肝癌的发生中存在交互作用。5.XRCC1基因Arg194/Trp Arg280His基因多态性与肝癌的遗传易感性无关。