鬼臼毒素固体脂质纳米粒的皮肤毒理学实验研究

论文摘要

背景：尖锐湿疣（condyloma acuminatum，CA）是由人类乳头瘤病毒（human papilloma virus，HPV）感染引起的临床常见性传播疾病，目前仅次于淋病位居我国性传播疾病的第二位。CA具有高复发特性，且部分可转化为鳞癌或宫颈癌，因此CA已成为危害人类健康不可忽视的问题。鬼臼毒素（podophyllotoxin，PPT）是从鬼臼树脂类木脂素中分离得到的具有显著细胞毒性的天然活性物质。0.5％鬼臼毒素酊剂是WHO推荐治疗CA最有效的一线药物，因存在对皮肤刺激性较大、作用时间短、对HPV潜伏感染难以凑效、缺乏良好的皮肤靶向性及大面积使用易产生吸收毒性等不足而限制了其在临床进一步应用。固体脂质纳米粒（solid lipid nanoparticles，SLN）是近年皮肤靶向性药物载体研究的热点，被认为是脂质体的下一代替代载药制剂，局部给药具有生理相容性好、可控制药物释放、良好的靶向性、可避免化学不稳定药物的降解及减少药物对皮肤的刺激作用等多种优点，因此，固体脂质纳米粒作为药物载体应用于经皮给药系统具有良好的发展前景。目前，国内外尚无全面、系统的关于PPT的皮肤毒理学实验研究，PPT-SLN的基础研究才刚刚起步，其局部应用的安全性国内外也未见报道。为了增加PPT在皮肤中的滞留量，增强其对病变组织的靶向作用，延长其对病变细胞的作用时间，达到提高CA的治疗效果并减少CA复发同时又尽可能降低其局部和全身毒副作用的目的，我们以毒性低、生物相容性好的固体脂质材料—硬脂酸、十八烷酰胺为药物载体吸附或包裹PPT，以Brij78和大豆卵磷脂为混合表面活性剂，采用改良的乳化蒸发-低温固化法研制了PPT-SLN，并对其制备工艺、质量和经皮应用的安全性进行了初步实验研究。目的：1．探讨PPT-SLN的制备工艺。2．对PPT-SLN的质量进行考察。3．考察PPT-SLN经皮肤用药的安全性。方法：1．根据单因素考察和正交实验设计优化处方，以硬脂酸、十八烷酰胺为固体脂质载体，Brij78和大豆卵磷脂为混合表面活性剂，采用改良的乳化蒸发-低温固化法制备PPT-SLN。2．用透射电镜考察纳米粒的形态；用Zeta-sizer粒径分析仪检测纳米粒粒径大小和电位；用高效液相色谱法测定纳米粒中PPT的包封率；用PH计测定纳米粒PH值。3．选择Wistar大鼠220只，Fmmu豚鼠120只。采用相同配方制备0.05％PPT-SLN、0.1％PPT-SLN、0.5％PPT-SLN和空白SLN，并以0.5％PPT酊剂作为对照。①取豚鼠40只，按随机数字表法分成0.05％PPT-SLN、0.1％PPT-SLN、0.5％PPT-SLN、空白SLN及0.5％PPT酊剂完整皮肤组和破损皮肤组，每组4只，进行单次给药皮肤刺激试验。给药方法：实验开始前24h豚鼠背部两侧对称脱毛后用手术刀片作#字划痕，以渗血为度。采用同体左右侧自身对照法，左侧为受试区，分别取0.05％PPT-SLN、0.1％PPT-SLN、0.5％PPT-SLN、空白SLN混悬液及0.5％PPT酊剂0.1mL均匀涂布于受试区，右侧为空白对照区，再以自制单层塑料薄膜和双层纱布封包受试区。分别于去除敷料和清洗受试物后1，24，48h观察涂药部位有无红斑和水肿等情况，以及上述变化的恢复情况与时间。另取豚鼠40只，分组同单次皮肤刺激试验，进行多次给药皮肤刺激试验。皮肤处理方法、观察指标及评价指标同单次皮肤刺激试验，每日给药1次，连续给药14d。②取大鼠110只，按随机数字表法分成0.05％PPT-SLN、0.1％PPT-SLN、0.5％PPT-SLN、空白SLN及0.5％PPT酊剂完整皮肤组和破损皮肤组及正常对照组，每组10只，进行皮肤急性毒性试验。试验方法：脱毛后，分别取0.05％PPT-SLN、0.1％PPT-SLN、0.5％PPT-SLN、空白SLN混悬液及0.5％PPT酊剂1mL均匀涂布于受试区，连续观察14d，每日观察大鼠体重、进食量、呼吸、体态、眼、中枢神经系统、四肢活动、粪便性状及死亡情况。另取大鼠110只，分组同皮肤急性毒性试验，进行皮肤长期毒性试验。皮肤处理方法及观察指标同皮肤急性毒性试验，每日给药1次，药量均为0.1mL，连续给药30d，末次给药后24h麻醉动物，取血3～4mL进行血液学、血液生化学检查并切取各组大鼠涂药中心区域的皮肤组织行皮肤病理检查及激光共聚焦显微镜扫描。③取豚鼠40只，按随机数字表法分成0.5％PPT-SLN组、0.5％PPT酊剂组、阴性对照组及阳性对照组，每组10只，进行皮肤变态反应试验。方法：脱毛后，4组左侧脱毛区分别涂0.5％PPT-SLN混悬液、0.5％PPT酊剂组、空白SLN混悬液及1％2，4，2-硝基氯苯0.1mL，涂药后以自制单层塑料薄膜和双层纱布封包受试区，6h后去除敷料和清洗受试物。第7d和第14d，以同样方法各重复1次，共3次。于末次给受试物致敏后14d，将受试物0.1mL涂于豚鼠背部右侧脱毛区，6h后去掉受试物，即刻观察皮肤变态反应情况，之后于24，48，72h再次观察皮肤反应。4．统计分析：以SPSS13.0统计软件对实验数据进行统计分析，计量资料以（?）±S表示，两组组间显著性检验用独立样本t检验；多组组间显著性检验用One-way Annova分析，当P＜0.05时，差异有统计学意义。结果：1．制备的PPT-SLN混悬液外观为半透明、淡乳色、质地均匀及带淡蓝色乳光的胶体状分散体系。2．透射电镜下PPT-SLN基本呈圆形或椭圆形；Zeta-sizer粒径分析仪检测纳米粒粒径和电位分别为75.3nm±26.2nm、23.2mV±3.1mV；高效液相色谱法测定纳米粒中PPT的包封率为86.4％；PH计测定纳米粒PH值为4.66±0.18。3．实验大鼠220只，豚鼠120只，均进入结果分析。PPT-SLN皮肤毒理学研究显示：在有效观察时间和一定浓度范围内①单次和多次给予PPT-SLN及其基质对豚鼠皮肤均无刺激性；单次给予0.5％PPT酊剂对豚鼠完整皮肤无刺激性，对破损皮肤有较强的刺激性；多次给予0.5％PPT酊剂对豚鼠完整皮肤、破损皮肤均有较强的刺激性，其中破损皮肤组豚鼠皮肤刺激性出现的最早和最严重。②0.5％PPT-SLN和0.5％PPT酊剂单次大剂量应用时大鼠容易出现短期的系统吸收毒性，尤以皮肤破损组症状较明显，其中0.5％PPT酊剂组大鼠中毒症状持续时间均较0.5％PPT-SLN组持久。0.05％PPT-SLN，0.1％PPT-SLN、空白SLN组大鼠应用则相对安全未见系统吸收中毒症状。③小剂量长期应用PPT-SLN、空白SLN和PPT酊剂对大鼠比较安全无系统吸收毒性；应用0.5％PPT-SLN、0.1％PPT-SLN时大鼠可出现以表皮为主轻度的皮肤急性炎症反应，其中0.5％PPT-SLN组大鼠皮肤炎症反应出现得相对较早并可有毛发生长障碍；应用0.5％PPT酊剂时大鼠可出现重度皮肤全层急性炎症反应及明显毛发生长障碍。④PPT-SLN组大鼠药物主要富集于表皮层和毛囊及其周围而真皮及皮下组织药物含量相对较少，较PPT酊剂组具有良好的皮肤靶向性；PPT-SLN组大鼠药物在皮肤各层的富集量随着药物浓度的增加而增大。⑤PPT酊剂、PPT-SLN及其基质对豚鼠皮肤均无致敏性。结论：1．PPT-SLN制备工艺简单，质量较理想。2．本项实验研究表明，在有效观察时间和一定浓度范围内，PPT-SLN、PPT酊剂对实验动物均无严重系统吸收毒性，但PPT-SLN与PPT酊剂相比具有局部不良反应少，不良反应程度轻，不良反应出现迟，皮肤靶向性好等优点。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 前言
• 第二章 鬼臼毒素固体脂质纳米粒的制备
• 2.1 材料
• 2.2 方法
• 2.3 结果
• 2.4 讨论
• 第三章 鬼臼毒素固体脂质纳米粒的质量考察
• 3.1 材料
• 3.2 方法
• 3.3 结果
• 3.4 讨论
• 第四章 鬼臼毒素固体脂质纳米粒的皮肤毒理学实验研究
• 4.1 材料
• 4.2 方法
• 4.3 结果
• 4.4 讨论
• 第五章 全文总结
• 参考文献
• 附图
• 英文缩写词对照表
• 成果
• 综述
• 致谢