芫花黄酮苷元的制备及其构效关系研究

论文摘要

目的:针对芫花中3种主要黄酮苷元成分芹菜素、芫花素、3’-羟基芫花素,建立含量测定方法;建立单体成分的制备工艺并对其部分工艺条件进行优化;对芫花炮制前后和其中单体成分的镇咳祛痰药理作用,以及芫花不同极性提取物和其单体成分的抗氧化作用进行初步研究,为芫花的有效开发利用提供依据。对其单体成分构效关系进行研究,为化合物结构改造及先导化合物的筛选提供依据。材料与方法:材料:芫花药材（安国）,芹菜素对照品（昆明科翔生物科技有限公司）,芫花素对照品（由中国中医科学院中药研究所毛淑杰研究员提供）;HP-20树脂（日本三菱化学株式会社）、D-312树脂（山东鲁抗立科药物化学有限公司）、DM-301、HPD-600树脂（沧州宝恩吸附材料科技有限公司）,AB-8树脂（南开大学化工厂）;聚酰胺（100-200目,沧州宝恩吸附材料科技有限公司）,硅胶（200-300目,青岛海洋化工）;昆明种小鼠（大连医科大学实验动物中心提供）。方法:1、采用HPLC法对芫花药材中的芹菜素、芫花素、3’-羟基芫花素3种黄酮苷元成分进行含量测定及方法学考察。2、采用超声提取法、溶剂热提取法、冷浸法提取芫花中的3种黄酮苷元成分,通过单因素与正交实验相结合,对提取工艺进行优化。3、利用大孔树脂对3种黄酮苷元成分粗提取物进行初步纯化,通过单因素实验筛选确定最佳纯化条件。4、利用硅胶和聚酰胺柱层析分离制备3种黄酮苷元成分单体。5、采用体外羟自由基和超氧阴离子自由基清除实验对芫花及其单体成分的抗氧化作用及其构效关系进行研究。6、采用氨水刺激法和气管段酚红法对芫花及其单体成分镇咳祛痰作用及其构效关系进行研究。结果:1、对芫花药材中的芹菜素、3’-羟基芫花素、芫花素HPLC含量测定方法进行了方法学考察,结果符合要求。并对2批芫花药材的含量进行了测定,分别为4.7974 mg·g-1,2.8910 mg·g-1,3.4094 mg·g-1和3.7922 mg·g-1,2.3771 mg·g-1,2.6956 mg·g-1。2、经单因素和正交实验,确定3种黄酮苷元成分溶剂热提取法最佳提取工艺为:药材经粉碎后,在60℃提取温度下按物料比1:10加入70%乙醇,每次提取1h,提取3次;超声提取法最佳提取工艺为:药材粉碎后,于室温下按物料比1:15加入70%乙醇,每次提取30min,提取3次。经比较,不同提取方法的提取效果依次为溶剂热提取〉超声提取〉冷浸提取。3、大孔树脂纯化工艺条件为:树脂型号为AB-8,上样醇浓度为35%,上样药液浓度为0.1g生药·mL-1, pH值为pH4～5,上样体积为16BV（16倍柱体积）。上样后先以20BV 20%乙醇除杂,再以9BV pH5～6的95%乙醇洗脱。经树脂处理后3种黄酮苷元总纯度由4.3%提升至8.9%,纯化率206.4%。4、经聚酰胺柱层析分离制备的芫花素、芹菜素、3’-羟基芫花素单体纯度分别为97.0%,82.2%,86.3%,收率分别为49.5%,45.4%,36.9%;经硅胶柱层析分离制备的3种黄酮苷元成分单体纯度分别为93.7%,78.0%,74.9%,收率分别为35.3%,49.6%,30.1%。5、经实验证明,芫花不同极性提取物均具有一定抗氧化活性,其中以乙酸乙酯和甲醇提取物抗氧化活性最强;芫花素、芹菜素、3’-羟基芫花素的羟自由基清除IC50分别为0.096 mg·mL-1,0.072 mg·mL-1,0.063 mg·mL-1;超氧阴离子清除IC50分别为0.375 mg·mL-1,0.362 mg·mL-1,0.147 mg·mL-1,且均呈现明显的量效关系。通过构效比较发现:黄酮化合物B环上酚羟基越多,抗氧化能力越强;A环7位酚羟基对分子抗氧化能力有贡献作用;酚羟基位于B环上的抗氧化效果可能优于其位于A环上的效果。以上构效关系对黄酮化合物超氧阴离子清除能力的影响比其对羟自由基清除能力的影响更显著。6、经药理实验证明,芫花炮制后镇咳祛痰作用无明显变化;通过灌胃给药,发现3种黄酮苷元均具有显著镇咳祛痰作用,在中剂量(300mg·kg-1)、低剂量(150mg·kg-1)具有一定的构效关系——黄酮分子结构中的A环7位酚羟基经甲氧基化后,有助于提高其镇咳效果;B环酚羟基数目增加及A环7位酚羟基经甲氧基化后,有助于提高其祛痰作用。结论:1、建立了芫花药材中的3种黄酮苷元芹菜素、芫花素、3’-羟基芫花素HPLC含量测定方法,该法简便、迅速,为芫花成分提取分离工艺和药材质量控制研究提供基础。2、经比较和工艺优化,确定了芫花3种黄酮苷元的最佳制备方法及最佳工艺。3、实验发现芫花提取物具有良好的抗氧化性,为芫花药材的开发利用提供了实验依据。4、通过药理实验为芫花炮制机理的研究提供了依据;明确了3种黄酮苷元抗氧化活性和镇咳祛痰活性的部分构效关系,对黄酮类化合物抗氧化活性构效关系研究进行了进一步补充,并为其镇咳祛痰活性构效关系研究提供了实验依据。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 前言
• 文献综述
• 一、 芫花黄酮化学成分及其药理作用
• 二、黄酮化合物分离纯化技术
• 三、黄酮化合物药理活性及其构效关系研究进展
• 参考文献
• 第一章 芫花中黄酮苷元成分的含量测定
• 1 仪器及试剂
• 2.实验方法
• 3 方法学考察
• 4 小结
• 第二章 芫花黄酮苷元成分提取工艺研究
• 第一节 超声提取法工艺研究
• 第二节 溶剂热提法工艺研究
• 第三章 大孔树脂纯化芫花黄酮苷元工艺研究
• 1 仪器与试剂
• 2 实验方法
• 3 小结
• 第四章 芫花黄酮苷元单体分离研究
• 1 仪器及试剂
• 2 实验方法
• 3 小结
• 第五章 芫花成分抗氧化活性及构效关系研究
• 1 仪器及试剂
• 2 实验方法
• 第六章 芫花成分镇咳祛痰作用及构效关系研究
• 第一节 芫花成分镇咳作用研究
• 第二节 芫花成分祛痰作用研究
• 分析讨论
• 结论
• 参考文献
• 致谢
• 个人简介
• 附图