人可溶性鸟苷酸环化酶α2β1的基因克隆、蛋白表达纯化及其结构与性质研究

论文摘要

内源性NO是具有多种生理功能的信使,在心血管系统中可以调节血管舒张、平滑肌松弛、血小板凝聚,而在中枢神经系统中主要参与调节神经发育、突触传递、突触可塑性、长程记忆。可溶性鸟苷酸环化酶（soluble guanylate cyclase,sGC）是介导NO信号转导,产生二级信使分子cGMP的核心金属酶。生命体内NO-sGC-cGMP信号通路的失调可能导致多种疾病的发生,包括心血管疾病：高血压、心力衰竭、动脉粥样硬化和神经退行性疾病等。因此,研究sGC介导NO信号转导的结构基础可以为重大疾病的病理机制和药物设计提供思路。可溶性鸟苷酸环化酶是含有b-型血红素辅基,由α和β两个亚基组成的异源二聚体蛋白。在生物体内主要以两种形式存在：α1β1和α2β1,这两种亚型最大的区别在于它们的细胞定位和组织分布不同。α1β1大量表达于各组织的细胞溶质中,而α2β1主要存在于脑、胎盘和子宫。α2β1可以与突触衔接蛋白PSD-95发生相互作用,参与大脑神经元通信,从而影响学习和记忆。目前关于sGC的研究主要集中于alβ1,很少有α2β1在分子水平上的研究报道。本文运用分子生物学和蛋白质化学方法,对hsGC α2β1的N端血红素结构域和中间结构域,以及hsGC α2的C端催化结构域及全长蛋白进行了基因克隆和表达纯化研究。我们首次成功建立了hsGC α2亚基单独的血红素结构域蛋白（hsGC α2H）和通过linker连接的异源二聚血红素结构域蛋白（hsGC β1H-α2H, hsGC α2H-β1H）及中间结构域蛋白（hsGC α2CC-β1CC）的大肠杆菌高效表达纯化体系。并对分离纯化得到的高产量、高纯度且聚集形式单一的hsGC α2H和hsGCα2CC-β1CC,通过MALDI-TOF-MS对这两种蛋白的分子量进行了鉴定。我们对hsGC α2β1的血红素结构域进行了结构表征和性质研究。通过吡啶血红素光谱,我们证实了经过heme重组后的hsGC α2H，hsGC β1H-α2H, hsGCα2H-β1H三种蛋白,95%都是以全血红素蛋白的形式存在。我们测定了重组后三种蛋白在氧化态、还原态及结合NO、CO状态下的紫外可见光谱,并通过电子顺磁光谱对三种蛋白的金属中心结构进行表征。实验结果表明氧化态三种蛋白中的heme都不含轴向配体或只含有很弱的配体,如H20；还原状态结合NO后都在g=2.009和g=2.068处出现了典型的5配位血红素-亚硝酰物质的三重超精细分裂信号峰。这与之前报道的hsGCβ195、hsGC α259及从组织提取的异源二聚体sGC结合NO后的信号一致。说明这三种蛋白都形成了具有一定功能的正确折叠。通过CO滴定及NO解离实验,我们研究了hsGC α2β1血红素结构域与配体NO/CO的相互作用。CO滴定时,hsGC α2H和hsGC β1H-α2H在428nm处有等吸收点,表明CO通过一步反应没有形成中间过渡态直接结合到这两种蛋白上。hsGC α2H和hsGC β1H-α2H的CO平衡解离常数Kd分别为2.2μM和1.6μM,而hsGCα2H-β1H的Kd为1.1μM。NO解离实验表明,NO从hsGCα2H和hsGC β1H-α2H中解离为二级反应,其中包含一个快反应（NO解离）和一个慢反应（蛋白构象变化）,而NO从hsGC α2H-β1H中解离为一级反应,可能因为hsGC α2H和hsGC β1H-α2H两种蛋白起始时为开放状态NO-heme*5C和闭合状态heme-NO5c的混合物,而hsGC α2H-β1H起始时只含一种状态。由此可见,NO从sGC中解离的机理非常复杂,有待深入研究。通过heme转移实验和荧光光谱我们研究了hsGC α2β1中血红素辅基与蛋白的相互作用,发现sGC中heme的解离速率比较大,因此在纯化sGC的过程中heme容易丢失。另外我们还通过圆二色光谱和傅里叶变化红外光谱研究了hsGC α2β1血红素结构域的二级结构,以及重组heme对三种蛋白二级结构产生扰动的情况。我们发现重组heme对hsGC α2H-β1H的二级结构影响比较大。本论文首次成功建立了hsGC α2β1的大肠杆菌高效表达纯化体系,该体系的建立为sGC的晶体结构研究奠定了基础；首次对hsGC α2β1血红素结构域进行了结构表征和性质研究,该工作为揭示神经系统中sGC介导的NO信号转导机制提供了信息。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 绪论
• 第一节 NO信号转导的重要意义
• 1.1.1 NO-sGC-cGMP通路
• 1.1.2 NO的生物介成
• 1.1.3 sGC介导的NO信号转导机制
• 1.1.4 NO-sGC-cGMP信号转导与递质释放
• 第二节 可溶性鸟苷酸环化酶（sGC）研究进展
• 1.2.1 sGC的分布
• 1.2.2 sGC的结构
• 1.2.3 sGC与化学小分子的相互作用
• 1.2.4 sGC α2亚基相关研究
• 第三节 本论文研究的目标和主要研究内容
• 1.3.1 研究的主要目标
• 1.3.2 研究内容
• 参考文献
• 第二章 人源性hsGC α2β1相关蛋白的基因克隆、蛋白表达与纯化
• 引言
• 第一节 hsGC α2β1血红素结构域相关蛋白的基因克隆、蛋白表达与纯化
• 2.1.1 实验材料
• 2.1.2 实验内容
• 2.1.3 实验结果与讨论
• 第二节 hsGC α2β1中间结构域相关蛋白的基因克隆、蛋白表达与纯化
• 2.2.1 实验材料
• 2.2.2 实验内容
• 2.2.3 实验结果与讨论
• 第三节 hsGC α2催化结构域及全长的基因克隆、蛋白表达与纯化
• 2.3.1 实验材料
• 2.3.2 实验内容
• 2.3.3 实验结果与讨论
• 小结
• 参考文献
• 第三章 hsGC α2β1血红素结构域相关蛋白的结构表征和性质研究
• 引言
• 第一节 hsGC α2β1血红素结构域相关蛋白金属中心结构表征
• 3.1.1 实验材料
• 3.1.2 实验原理
• 3.1.3 实验内容
• 3.1.4 实验结果与讨论
• 第二节 hsGC α2β1血红素结构域相关蛋白与NO/CO相互作用研究
• 3.2.1 实验材料
• 3.2.2 实验原理
• 3.2.3 实验内容
• 3.2.4 实验结果与讨论
• 第三节 hsGC α2β1血红素辅基与相关蛋白的相互作用研究
• 3.3.1 实验材料
• 3.3.2 实验原理
• 3.3.3 实验内容
• 3.3.4 实验结果与讨论
• 第四节 hsGC α2β1血红素结构域相关蛋白二级结构研究
• 3.4.1 实验材料
• 3.4.2 实验原理
• 3.4.3 实验内容
• 3.4.4 实验结果与讨论
• 小结
• 参考文献
• 工作总结和展望
• 工作总结
• 工作展望
• 附录
• 攻读硕士学位期间已发表和完成的论文
• 致谢