论文摘要
龙须菜（Gracilaria /Gracilariopsis lemaneiformis）是一种大型海藻,属于红藻门,杉藻目,江蓠科。龙须菜的分类地位一直存在争议,对于龙须菜属于Gracilariopsis属还是江蓠属没有确定的答案。Gurge（l1991）就将江蓠科（Gracilariaceae）分成Melanthalia和Curdiea, Gracilariopsis, Gracilaria三个不同属。本文对龙须菜居群内不同个体的5. 8S rDNA - ITS区进行了PCR扩增和序列分析,扩增DNA片段长度均为1066bp,包含完整的ITS1（250 bp）、5. 8S （159bp）和ITS2 （657bp） ,在青岛产龙须菜的居群内不存在遗传差异;利用NCBI资源对江蓠属和Gracilariopsis属共20个物种的rDNA-ITS相应序列进行了比较和系统进化分析,结果表明,龙须菜和江蓠科19个物种中rDNA的5. 8S区的长度和序列非常保守,而ITS区的长度和序列则变异较大,20种江蓠科物种的遗传距离在0. 013～0. 596之间,龙须菜在5. 8S rDNA– ITS区特性上相比江蓠属物种与Gracilariopsis属物种更为相似;采用UPGMA法构建了这20种江蓠科物种的系统发育树,分析结果表明青岛产龙须菜应属于Gracilariopsis属,并且在江蓠科中较早分化,而龙须菜处于Gracilariopsis属中比较古老的位置。龙须菜最重要的经济意义在于所产的琼胶,因其高琼胶含量及质量受到越来越多的关注。作为Gracilariopsis属内一种有重要经济价值的物种,利用分子生物学手段开展龙须菜产琼胶相关基因的研究,从遗传物质DNA的角度直接、充分地了解和研究龙须菜琼胶代谢机理和调控,无疑将为更好地开发和利用该经济物种奠定坚实的基础。我们选取龙须菜琼胶合成过程中的关键酶—半乳糖-1-磷酸尿苷酰转移酶（galactose-1-phosphate uridylyltransferase ,GALT）,根据相近物种galt基因序列设计兼并引物,利用RT-PCR方法获得galt基因cDNA部分序列,采用RACE方法分别获得galt cDNA的3’端序列,采用invitro cloning方法获得galt基因5’端序列。根据所得结果拼接得到galt基因1240bp cDNA全长,序列全长包括1086bp的开放阅读框和151bp 3’端非编码区,共编码362个氨基酸;得到1447bp长的DNA序列,序列内没有内含子。rpsBLAST分析表明在C端和N端都具有保守的Zn2+、Fe2+结合位点和能够引起酶失活的组氨酸三联体（HIT元件）;此外,在氨基酸序列的166-175位点有一段高度保守的酶活性位点区。Southern blotting结果显示galt基因在龙须菜基因组中只存在一个拷贝。选取同一群体内的龙须菜,提取琼胶后,发现不同的藻株琼胶含量存在差距,挑取其中相差较大的两组藻株提取RNA,反转录为cDNA后,用荧光实时定量PCR的方法测定琼胶含量不同两组藻株galt基因的表达,以法来处理数据,表示目的基因的相对表达量。数据显示,琼胶含量与galt基因的表达存在相关性,低琼胶含量的藻株galt基因的表达量低,高琼胶含量的藻株galt基因的表达大部分较高,但由于GALT蛋白量少、酶活性低或者琼胶合成路径中其他酶的作用使得galt基因的表达与琼胶含量不成正比。半乳糖-1-磷酸尿苷酰转移酶可能不是整个途径中的开关酶,藻体中琼胶含量的高低并不是由半乳糖-1-磷酸尿苷酰转移酶直接控制。但我们的研究结果也显示了半乳糖-1-磷酸尿苷酰转移酶基因与琼胶含量的高度相关性,将可开发作为龙须菜高琼胶含量的指标。由于目前对江蓠属产琼胶品种的琼胶合成路径缺乏系统的研究,对整个碳代谢尤其是琼胶合成过程了解的还很有限,因此筛选出对琼胶合成起关键作用的酶系并对其进行分析利用,需要进一步的研究。