猪产肠毒素型大肠杆菌F41受体基因的精细定位与鉴别

论文摘要

产肠毒素大肠杆菌（enterotoxigenic Escherichia coli ETEC）是引发新生及断奶仔猪腹泻和水肿的主要致病菌。ETEC主要存在五种血清型,包括F4、F41、F5、F6和F18。ETEC F41作为其中的一种血清型,是引起仔猪腹泻的重要病原菌之一,其通过表面表达的黏附素与猪小肠上皮细胞的特异性受体结合,释放肠毒素进而引起大量电解质和水渗入肠腔,从而导致仔猪腹泻。本课题组前期利用183个微卫星标记在大规模白色杜洛克×二花脸资源家系群体中开展全基因组扫描,将ETECF41受体基因初步定位在猪4号染色体SW2509和S0301标记间约6.04 Mb的区域。在此基础上,本研究通过在SSC4 QTL目标区域增加7个微卫星标记,对其在同一资源群体（包括816个F2个体及所有Fo与F1个体）中开展基因分型,进一步将ETEC F41受体基因精细定位至标记SW2509至KVL2754之间约2.42 Mb的区域,为鉴别ETEC F41受体目的基因奠定了良好的工作基础。在所定位的2.42 Mb目标区域中,采用比较基因组学分析,揭示该区域目前存在21个基因,从中选取6个可能的位置候选基因（包括ST3GAL1、TMEM71、ASAP1、NDRG1、ZFAT、KCNQ3基因）通过半定量RT-PCR检测其在猪空肠组织中的表达,结果表明这6个基因在空肠中均表达。进一步结合ETEC F41受体的理化特性选择ST3p-半乳糖α-2,3唾液酸转移酶1（ST3GAL1）基因作为ETEC F41受体的重要位置候选基因加以研究。采用5’RACE和3’RACE技术,分离了ST3GAL1基因全长1637 bp的cDNA序列,其中开放阅读框（Open Reading Frame, ORF）为1032 bp,编码343个氨基酸。通过比较测序法在ST3GAL1基因内共鉴别到62个多态位点,其中2个错义突变（ST3GAL1 c.284T>A和ST3GAL1 c.661A>G）,11个同义突变,49个内含子上的突变。采用PCR-RFLP和PCR-SNaPshot方法对ST3GAL1 c.284T>A（位于第1外显子）、c.477C>T（位于第2外显子）及c.661A>G（位于第3外显子）等3个多态位点在白色杜洛克×二花脸资源家系所有个体中进行多态性检测。传递不平衡检测表明除c.477C>T位点外,另两个多态位点的等位基因及所有单倍型均与ETEC F41的易感性呈极显著相关（P<0.01）。为此,本实验选择两个强关联的SNPs位点（ST3GAL1c.284T>A及c.661A>G）进一步在287头中、西方猪种远缘群体中开展遗传多态性分析,采用Case Control力法分析,结果表明ST3GAL1 c.284T>A及c.661A>G两个多态位点在中、西方猪种远缘群体中与ETEC F41黏附表型关联性均不显著。由此提示ST3GAL1基因与ETECF41黏附表型的关联性可能存在群体异质性,另外ST3GAL1基因可能不是目的基因而仅是与目的基因处于一定连锁不平衡状态的一个标记位点。为了获得更高的基因定位精度,本研究采用猪全基因组高通量60K SNP芯片对白色杜洛克×二花脸资源群体开展全基因组关联分析（Genome-wide association study, G WAS）,以精细定位ETEC F41受体基因位点。GWAS结果显示,与ETEC F41黏附表型具有最显著关联的SNP位点为H3GA0011673 C>T（P=1.09E-09）,与其临近的两个多态位点为ASGA0017715 T>C和ASGA0017733 C>T。进一步对这三个多态位点在287头中、西方猪种中采用PCR-SNaPshot方法进行多态性检测,结果表明仅ASGA0017733 C>T多态位点在西方猪种中与ETEC F41黏附表型显著关联。由此提示,ASGA0017733 C>T位点可能是与目的基因处于连锁不平衡的一个重要标记,这为进一步开展位置候选基因研究奠定良好的基础。ASGA0017733 C>T位点位于ZFAT基因第3内含子上,结合受体生理生化分析,本实验选择ZFAT （zinc finger and AT hook domain containing）作为ETEC F41受体位置候选基因进一步深入研究。采用RACE技术分离得到长4108 bp的猪ZFAT cDNA序列,开放阅读框（ORF）长3393 bp,编码1130个氨基酸。通过比较测序在ZFAT基因编码区鉴别到c.60C>T、c.630A>C、c.660T>C、c.1077T>C、c.1416T>C、c.2337T>C及c.2935G>C共7个多态位点,其中1个为错义突变,6个为同义突变。采用PCR-SNaPshot技术检测这7个多态位点在中、西方猪种远缘群体287个个体中的多态性。连锁不平衡（Linkage Disequilibrium, LD）分析表明大多数SNP位点均存在不同程度的连锁不平衡,但在西方猪种中的LD程度高于中国地方猪种。关联性分析表明：在中国地方猪种中仅2337T>C位点与ETEC F41黏附表型显著相关（P<0.05）；而在西方猪种中,除c.630A>C和c.660T>C位点与ETEC F41黏附表型相关性不显著外,其余5个多态位点与ETEC F41黏附表型显著相关（P<0.05）,表明这些多态位点可能位于ETEC F41受体基因之中或与其处于连锁不平衡状态,这些结果为ETECF41受体基因的精细定位提供了重要的分子标记。本研究不仅证实了与ETEC F41侵染相关的主效QTL位于猪4号染色体上,而且进一步将目标区域缩小至标记SW2509-KVL2754（5.56 Mb-7.98 Mb）间,为最终确定ETEC F41受体目的基因及其因果突变奠定了重要的前期工作基础。通过对位置候选基因ST3GAL1和ZFAT基因的克隆及多态性分析,鉴别到的与ETEC F41黏附表型显著相关的位点为利用标记辅助选择（MAS）开展抗ETEC F41腹泻病分子遗传育种提供了很好的分子标记。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 目录
• 第一章 文献综述
• 1.1 引言
• 1.2 大肠杆菌简介
• 1.2.1 大肠杆菌的特性及种类
• 1.2.2 大肠杆菌的抗原结构
• 1.2.3 大肠杆菌的肠毒素
• 1.2.4 大肠杆菌菌毛种类
• 1.2.5 大肠杆菌的受体
• 1.2.6 大肠杆菌的致病机理
• 1.2.7 猪大肠杆菌性疾病
• 1.2.8 仔猪大肠杆菌病的防治
• 1.2.9 大肠杆菌腹泻病的分子抗病育种的可行性
• 1.2.9.1 ETEC F4ac分子抗病育种
• 1.2.9.2 ETEC F18分子抗病育种
• 1.3 ETEC F41研究进展
• 1.3.1 ETEC F41流行病学
• 1.3.2 ETEC F41黏附素
• 1.3.3 ETEC F41受体特性
• 1.3.4 ETEC F41致病机理
• 1.3.5 ETEC F41受体遗传学研究
• 1.3.5.1 ETEC F41受体的全基因组连锁定位分析
• 1.3.5.2 ETEC F41受体位置候选基因研究进展
• 1.3.5.2.1 ST3GAL1基因研究进展
• 1.3.5.2.2 ZFAT基因研究进展
• 1.4 畜禽重要经济性状基因座的定位
• 1.4.1 畜禽QTL定位的基本方法
• 1.4.1.1 候选基因法
• 1.4.1.2 标记-QTL连锁分析法
• 1.4.1.3 QTL定位中所使用的模型和统计方法
• 1.4.2 畜禽QTL精细定位
• 1.4.2.1 增加标记密度
• 1.4.2.2 扩大群体规模
• 1.4.2.3 改变实验群体设计
• 1.4.3 提高QTL精细定位的新策略
• 1.4.3.1 传递不平衡检验（TDT）定位
• 1.4.3.2 后裔同源相同IBD定位
• 1.4.3.3 连锁不平衡-连锁（LDLA）定位
• 1.4.3.4 选择性清除效应分析精细定位QTL
• 1.5 家畜重要经济性状基因定位的新策略-全基因组关联分析（GWAS）
• 1.5.1 全基因组关联分析（GWAS）的基本原理
• 1.5.2 全基因组关联分析（GWAS）的应用
• 1.5.2.1 GWAS在家畜单基因性状位点定位中的应用
• 1.5.2.2 GWAS在家畜多基因控制的复杂性状位点定位中的应用
• 1.6 本研究的目的和意义
• 1.6.1 本研究的目的
• 1.6.2 本研究的意义
• 第二章 基于微卫星标记的猪4号染色体ETEC F41受体基因的精细定位
• 2.1 引言
• 2.2 材料与方法
• 2.2.1 实验动物
• 2.2.2 黏附表型判定
• 2.2.2.1 实验菌株
• 2.2.2.2 刷状缘的提取
• 2.2.2.3 黏附实验
• 2.2.3 基于微卫星标记的ETEC F41受体基因精细定位
• 2.2.3.1 新增微卫星标记的选择
• 2.2.3.2 微卫星标记的基因型检测
• 2.2.4 总RNA的提取
• 2.2.5 位置候选基因的空肠组织表达谱分析
• 2.2.6 统计方法
• 2.3 结果
• 2.3.1 ETEC F41黏附表型分布
• 2.3.2 微卫星标记基因型检测结果
• 2.3.3 SSC4上微卫星标记遗传图谱
• 2.3.4 ETEC F41受体基因精细定位结果
• 2.3.5 总RNA提取结果
• 2.3.6 六个位置候选基因的组织表达谱分析
• 2.4 分析与讨论
• 2.5 小结
• 第三章 利用全基因组高通量SNP标记精细定位ETEC F41受体基因
• 3.1 引言
• 3.2 材料与方法
• 3.2.1 实验动物
• 3.2.2 全基因组芯片扫描
• 3.2.3 突变位点的基因分型
• 3.2.4 统计分析
• 3.2.4.1 全基因组关联分析
• 3.2.4.2 远缘群体中3个多态位点与ETEC F41黏附表型的关联性分析
• 3.3 结果
• 3.3.1 ETEC F41黏附表型分布
• 3.3.2 ETEC F41受体基因全基因组关联分析结果
• 3.3.3 资源群体强关联位点在远缘群体中基因型检测结果
• 3.3.4 目的标记位点在远缘群体中与ETEC F41黏附表型的关联性
• 3.3.5 目的标记位点的连锁不平衡（LD）分析
• 3.4 分析与讨论
• 3.4.1 关于ETEC F41黏附表型在远缘群体中的分布
• 3.4.2 关于ETEC F41受体基因全基因组关联分析
• 3.4.3 关于远缘群体中3个目的标记与ETEC F41黏附表型的关联分析
• 3.5 小结
• 第四章 位置候选基因ST3GAL1的分离及其与ETEC F41易感性的关联性研究
• 4.1 引言
• 4.2 材料与方法
• 4.2.1 实验动物
• 4.2.2 ST3GAL1基因全长cDNA的分离
• 4.2.3 ST3GAL1基因多态位点的鉴别及基因分型
• 4.2.3.1 ST3GAL1基因多态位点的鉴别
• 4.2.3.2 ST3GAL1基因多态位点的基因分型
• 4.2.4 统计分析
• 4.3 结果
• 4.3.1 ETECF41黏附表型分布
• 4.3.2 ST3GAL1基因全长cDNA
• 4.3.3 ST3GAL1基因多态位点的鉴别
• 4.3.4 ST3GAL1基因多态位点的检测
• A和c.477C>T多态位点的检测结果'>4.3.4.1 c.284T>A和c.477C>T多态位点的检测结果
• G多态位点的检测结果'>4.3.4.2 c.661A>G多态位点的检测结果
• 4.3.5 统计分析结果
• 4.3.5.1 多态位点的连锁不平衡检测
• 4.3.5.2 多态位点与ETEC F41黏附表型的关联性分析
• 4.3.5.2.1 多态位点与资源群体ETEC F41黏附表型的关联性分析
• 4.3.5.2.2 ST3GAL1基因2个多态位点与远缘群体ETEC F41黏附表型的关联性分析
• 4.4 分析与讨论
• 4.5 小结
• 第五章 位置候选基因ZFAT的分离及其与ETEC F41易感性的关联性研究
• 5.1 引言
• 5.2 材料与方法
• 5.2.1 实验动物
• 5.2.2 总RNA的提取
• 5.2.3 ZFAT基因全长cDNA的分离
• 5.2.4 ZFAT基因多态位点的鉴别及基因分型
• 5.2.4.1 ZFAT基因多态位点的鉴别
• 5.2.4.2 ZFAT基因多态位点的基因分型
• 5.2.5 统计分析
• 5.3 结果
• 5.3.1 总RNA提取结果
• 5.3.2 ZFAT基因全长cDNA
• 5.3.3 ZFAT基因多态位点的鉴别及多态性检测
• 5.3.3.1 ZFAT基因多态位点的鉴别
• 5.3.3.2 ZFAT基因多态位点的基因分型结果
• 5.3.4 统计分析结果
• 5.3.4.1 多态位点与ETEC F41黏附表型的关联性分析
• 5.3.4.2 多态位点的连锁不平衡检测
• 5.4 分析与讨论
• 5.4.1 猪ZFAT基因的生物信息学分析
• 5.4.2 ZFAT基因的多态位点与ETEC F41黏附表型的关联性分析
• 5.4.3 种群间的连锁不平衡分析
• 5.5 小结
• 全文总结与展望
• 参考文献
• 附录1 ST3GAL1基因组部分序列
• 附录2 ST3GAL1基因CDNA序列
• 附录3 ZFAT基因CDNA序列
• 附录4 博士研究生学习期间发表的论文情况
• 致谢