人类心脏发育候选基因ZNF649的克隆与功能研究

论文摘要

一系列控制着细胞分化,细胞基质形成的基因在不同的时空表达构成了心肌的分化过程。研究证实许多包含有KRAB的锌指蛋白（KRAB-ZFPs）与心脏发育以及心血管疾病都有密切的关系。本文作者筛选并鉴定出一个新的人类锌指基因并命名为ZNF649,其cDNA全长3176个碱基,编码一个长505个氨基酸残基的蛋白质。ZNF649在N端含有一个KRAB框,C端含有10个C2H2型锌指。使用生物信息学的方法分析表明ZNF649定位在染色体19q13.41上,在基因组上跨越了17Kb并包含了5个外显子。 RNA印迹试验表明ZNF649在人的成体和胚胎中都有表达,而在心脏和骨骼肌中表达强烈。ZNF649融合Gal-4的DNA结合区并与VP-16共转染的试验结果表明ZNF649是一个抑制因子,在COS7细胞中过表达ZNF649蛋白可以使MAPK信号途径的两个下游转录因子Ap-1和SRE的转录激活活性显著下降。将ZNF649基因中的结构域拆片进行分析的试验表明KRAB基元是个非常重要的结构域,抑制了SRE和AP-1的转录活性。这些结果表明,ZNF649蛋白很可能在MAPK的信号途径中充当了转录抑制子的角色,进而在细胞分化中起了重要的作用。 另外,本文还以鸡胚早期发育各时期的心脏为材料,建立了一套快速鉴定鸡胚发育时期的形态学标准,而且还将鸡胚心脏发育的关键事件与鸡胚发育时期各关键形态学特征联系起来,使得可以通过鸡胚

论文目录

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• 第一章 引言和文献综述
• 1 心脏发育的研究
• 2 人心脏发育调控基因
• 3 MAPK信号途径与心脏发育
• 3.1 MAPK途径简介
• 3.2 MAPK的四种途径
• 3.2.1 ERK途径
• 3.2.2 SAPK／JNK途径
• 3.2.3 p38途径
• 3.2.4 MKK5／MAPKerk途径：
• 3.3 MAPK途径之间相互作用
• 3.4 MAPK信号途径与心脏发育
• 4 锌指家族与心脏发育
• 4.1 锌指蛋白概述
• 4.2 C2H2型锌指蛋白
• 4.2.1 C2H2型结构特点
• 4.2.2 KRAB的结构
• 4.2.3 KRAB锌指蛋白的生理功能
• 4.2.4 KRAB框的转录抑制作用
• 4.3 锌指蛋白与心脏发育
• 5 本文的研究意义
• 第二章 人类新基因ZNF649的克隆、序列分析及其功能研究
• 1 材料与方法
• 1.1 实验材料
• 1.1.1 主要材料
• 1.1.2 菌株和质粒
• 1.1.3 主要生化试剂
• 1.1.4 缓冲液和培养基
• 1.1.5 主要实验仪器
• 1.1.6 生物信息学分析的主要软件与数据库
• 1.2 实验方法
• 1.2.1 引物设计与合成
• 1.2.2 总RNA提取
• 1.2.3 反转录
• 1.2.4 巢式PCR反应
• 1.2.5 凝胶回收
• 1.2.6 连接
• 1.2.7 感受态细胞的制备
• 1.2.8 连接产物的转化
• 1.2.9 重组克隆的筛选和鉴定
• 1.2.10 质粒酶切
• 1.2.11 5′RACE
• 1.2.12 Northern杂交实验
• 1.2.13 真核表达重组质粒的大量制备
• 1.2.14 常规细胞培养及转染
• 1.2.15 亚细胞定位观察
• 1.2.16 基因信号途径的report assay
• 1.2.17 转基因稳定表达细胞系的建立
• 2 实验结果
• 2.1 ZNF649基因全长cDNA的克隆及序列分析
• 2.1.1 PCR产物电泳
• 2.1.2 重组质粒的鉴定
• 2.1.3 核苷酸序列测定
• 2.1.4 5′RACE PCR
• 2.2 Northern分析
• 2.3 ZNF649的基因结构及基因组定位
• 2.4 ZNF649的蛋白质生物信息学分析
• 2.5 ZNF649的细胞定位分析
• 2.6 ZNF649基因的Report Assay分析
• 2.7 ZNF649蛋白在MAPK途径中的转录活性分析
• 2.8 ZNF649中KRAB框的抑制作用
• 2.8.1 ZNF649结构域分段研究
• 2.8.2.ZNF328基因的结构域分段报告基因表达检测
• 3 讨论
• 第三章 其他方面的工作
• 1 利用模式动物鸡研究早期心脏发育
• 2 鸡胚各发育时期的主要形态学特征
• 3 鸡胚的培养及发育时期的确定
• 3.1 材料、仪器与试剂
• 3.2 实验方法
• 3.3 结果与分析
• 参考文献
• 附录
• 致谢