人类胚胎干细胞体外培养过程中Wnt基因在饲养层和人类胚胎干细胞中的差异表达及Wnt9a的RNAi研究；生精相关新基因Cymg1和Rcet1的克隆及初步功能研究

论文摘要

研究目的：对核型正常和异常的人类胚胎干细胞（hESCs）在体外培养过程中Wnt基因在饲养层和hESCs中的差异表达分析，分别筛选出可能促进hESCs正常增殖和引起核型发生变化的候选Wnt基因，并对其中的Wntga候选基因进行RNAi（RNA干扰）研究，了解其生理功能；在小鼠睾丸或生殖域中克隆与生精相关的新基因，并对其功能进行初步研究。 研究方法：用RT-PCR方法对核型正常和异常的hESCs在体外培养过程中Wnt基因在饲养层和hES细胞中的差异表达分析，分别筛选维持hESCs正常增殖和促使其核型变化的候选基因：用RT-PCR、原位杂交、免疫组化、细胞定位和过表达方法研究其定位和表达，并构建pAVU6+27／siWnt9as针对人Wnt9a RNA干扰的表达载体，采用原位杂交方法检测RNA干扰效应，以及流式分析过表达和低表达人Wnt9a对细胞周期的影响；应用DDD（数据库削减杂交）结合实验方法，克隆在睾丸或生殖域中特异表达的新基因，采用RT-PCR、Northern、原位杂交、免疫组化、蛋白表达和细胞定位等方法研究新基因的初步功能。 研究结果：①Wnt7a在培养核型正常hESCs 6天后的hEFs（人类胚胎成纤维细胞）和ICR小鼠胚胎成纤维细胞（mEFs）中表达，在对照和培养第一号染色体核型异常的hESCs 6天后的hEFs和ICR mEFs中无表达。Wnt3a在培养核型正常hESCs 6天后的ICR mEFs中高表达，在对照和培养核型异常hESCs 6天后的ICR小鼠mEFs中无表达。Wnt3在培养第一号染色体核型异常的hESCs 6天后的hEFs和ICRmEFs中表达，且表达量逐渐增强，对照和培养核型正常hESCs后的hEFs中无表达；但培养正常hESCs 6天后的ICR和昆明小白鼠mEFs中有Wnt3的表达；同时，昆明小白鼠mEFs对照中也有Wnt3的表达。Wnt9a的表达量在未培养正常hESCs的hEFs中表达量高，而在养hESCs后的hEFs中表达量低。Wnt16在培养正常hESCs 6天后的昆明小白鼠mEFs中有较高的表达，而对照和hEFs及ICR小鼠mEFs中均无Wnt16表达。②Wnt9a在人3个月胚胎的多组织中均表达；原位杂交和免疫组化表明Wnt9a在MCF-7人乳腺癌细胞和hESCs中表达；Wnt9a定位在胞浆中表达；原位杂交检测表明转染了pAVU6+27/siWnt9as的MCF-7细胞无杂交信号或杂交信号弱，未转染

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 专业名词缩写中英文对照表
• 实验技术路线图
• 第一章 综述
• 1.1 胚胎干细胞及信号调控
• 1.1.1 胚胎干细胞
• 1.1.2 胚胎干细胞自我更新相关的主要信号通路
• 1.1.3 胚胎干细胞自我更新过程中其他重要信号分子
• 1.2 Wnt基因的功能研究进展
• 1.3 RNA干扰研究
• 1.4 半胱氨酸蛋白酶抑制剂与精子发生
• 1.4.1 半胱氨酸蛋白酶抑制剂
• 1.4.2 精子发生
• 第二章 材料和方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 实验动物
• 2.1.2 细胞系
• 2.1.3 细菌和质粒
• 2.1.4 主要试剂及材料
• 2.1.5 主要仪器
• 2.1.6 引物
• 2.1.7 主要抗体
• 2.2 研究方法
• 2.2.1 生物信息学分析的主要软件与数据库
• 2.2.2 数据库消减杂交
• 2.2.3 多组织RT-PCR验证差异表达的结果
• 2.2.4 GenBank数据库检索和序列的计算机分析
• 2.2.5 阅读框架的实验验证
• 2.2.6 质粒DNA的提取和小量胶回收DNA
• 2.2.7 RNA的抽提
• 2.2.8 PCR反应
• 2.2.9 半定量RT-PCR
• 2.2.10 Northern杂交
• 2.2.11 组织原位杂交
• 2.2.12 Cymg1和Wnt9a基因多克隆抗体的制备
• 2.2.13 免疫组化
• 2.2.14 pQE-30／Cymg1基因融合蛋白的原核表达
• 2.2.15 Lipofectamine2000介导的基因瞬时转染
• 2.2.16 CYMG1蛋白的亚细胞定位
• 2.2.17 WNT9A蛋白的亚细胞定位
• 2.2.18 构建表达siWnt9as的pAVU6+27质粒
• 2.2.19 pAVU6+27／siWnt9as质粒瞬时转染MCF-7乳腺癌细胞
• 2.2.20 WNT9A蛋白的亚细胞定位及转染效率估算
• 2.2.21 瞬时转染RNA干扰效果的检测
• 2.2.22 流式细胞仪技术
• 2.2.23 流式细胞仪检测细胞凋亡和细胞周期
• 2.2.24 hESCs的核型检测
• 第三章 研究结果
• 3.1 Wnt基因在hES体外培养过程中的差异表达
• 3.1.1 hES细胞核型检测
• 3.1.2 Wnt在hES细胞体外培养过程中的差异表达
• 3.1.3 Wnt在癌细胞株和不同核型hESCs中表达
• 3.2 Human Wnt9a的RNA干扰研究
• 3.2.1 Human Wnt9a的生物信息学分析
• 3.2.2 Human Wnt9a功能的初步研究
• 3.2.3 Wnt9a的RNA干扰研究
• 3.3 Cymg1和Rcet1新基因的克隆和功能的初步研究
• 3.3.1 小鼠生精相关新基因Cymg1和Rcet1的克隆
• 3.3.2 新基因Cymg1和Rcet1的数字化表达图谱
• 3.3.3 新基因Cymg1和Rcet1的染色体定位及剪切位点分析
• 3.3.4 新基因Cymg1的酶切位点分析
• 3.3.5 新基因Cymg1和Rcet1的蛋白结构域、同源性及保守位点分析
• 3.3.6 CYMG1和RCET1蛋白质序列的计算机分析
• 3.3.7 多组织RT-PCR检测Cymg1和Rcet1基因的组织表达谱
• 3.3.8 Northern杂交法检测新基因Cymg1在小鼠多组织中的特异性表达
• v1,Rcet1_v2）基因在小鼠睾丸组织中的原位杂交'>3.3.9 Rcet1（Rcet1_v1,Rcet1_v2）基因在小鼠睾丸组织中的原位杂交
• 3.3.10 Cymg1基因在活细胞中的定位
• 3.3.11 pQE-30／CYMG1融合蛋白的原核表达
• 3.3.12 免疫组化
• 第四章 讨论
• 4.1 Wnt基因在hESCs体外培养过程中在feeder cells和hESCs中的差异表达
• 4.2 Human Wnt9a的RNAi研究
• 4.3 CYMG1和RCET1新基因的克隆和功能的初步研究
• 4.3.1 数据库消减杂交在睾丸特异性表达的新基因克隆中的应用
• 4.3.2 新基因Cymg1和Rcet1的表达特征
• 结论
• 参考文献
• 致谢
• 读博士期间发表论文目录
• 个人简历