基于巯基识别的DNA、蛋白质生物传感器的研制

论文摘要

本课题引入功能性的巯基识别物质结合荧光、电化学检测手段,研制了高灵敏、高特异性的检测含巯基的多肽、蛋白质以及DNA的生物传感器。具体的说,本论文的主要研究工作包括:（1）建立一种光谱型生物传感器,采用巯基特异性试剂N-（9-吖啶）马来酰亚胺（NAM）来检测表面固定的多肽以及DNA。作为模型体系,首先在烷基硫醇（MUA）自组装膜修饰的金电极表面固定还原型谷胱甘肽GSH,采用NAM标记GSH中的游离巯基生成具有荧光的衍生物,恒电位条件下脱附电极表面吸附物,检测脱附物在0.1mol·L-1KOH溶液中的荧光强度。GSH的检测限为40pmol·L-1。该方法可扩展到检测电极表面固定的六肽FT（含3个半胱氨酸残基）,脱附物的荧光强度约为GSH时的3倍,同FT与GSH中半胱氨酸残基的数量比相吻合。我们还采用该方法对表面固定的DNA进行了序列特异性分析,结果令人满意。该方法将电化学脱附与荧光检测相结合,具有灵敏度高、重现性好、样品用量少、快速准确等优点。（2）建立一种电化学生物传感器,采用双功能交联试剂N-（2-乙基-二茂铁）马来酰亚胺（Fc-Mi）检测表面固定的微量p53蛋白质。在金电极表面组装巯基化的单链ss-DNA探针/己硫醇（HT）混合自组装膜,随后单链ss-DNA探针与序列匹配的靶点DNA杂交。所形成的一致性双链DNA捕获溶液中的野生型p53蛋白质。利用Fc-Mi对p53分子表面的半胱氨酸残基衍生。p53与一致性双链DNA之间的特异性相互作用可通过检测二茂铁的电化学信号来指示。结果表明,碱基数目错配会大大影响双链DNA对野生型p53蛋白质的捕获。该方法可检测的p53最低浓度为1.33 nmol·L-1。上述生物传感器与采用溶液方法检测含巯基的多肽或蛋白质相比,具有灵敏度高、重现性好、样品用量少、快速准确等优点,为表面固定的生物分子的检测提供了有效的途径。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 绪论
• 1.1 生物传感器
• 1.1.1 生物传感器的定义与原理
• 1.1.2 生物传感器的发展历程
• 1.1.3 生物传类型及特点
• 1.1.4 生物传感器的应用情况及发展趋势
• 1.2 自组装膜技术
• 1.2.1 SAMs发展简史
• 1.2.2 SAMs的制备和动力学过程研究
• 1.2.3 SAMs的类型及优势
• 1.3 荧光光谱技术用于构建生物传感器的研究进展
• 1.3.1 蛋白质检测荧光光谱法的研究进展
• 1.3.2 蛋白质分子荧光探针的发展趋势
• 1.4 电化学生物传感器研究进展
• 1.4.1 DNA电化学传感器
• 1.4.2 蛋白质电化学传感器
• 1.5 论文工作的选题意义
• 第二章 多肽、蛋白质的荧光检测
• 2.1 引言
• 2.2 实验部分
• 2.2.1 实验试剂
• 2.2.2 实验仪器
• 2.3 实验过程
• 2.3.1 电极的预处理与活化
• 2.3.2 多肽以及DNA的表面固定
• 2.3.3 NAM的固定和电化学脱附
• 2.3.4 脱附物的荧光测定
• 2.4 结果与讨论
• 2.4.1 检测原理
• 2.4.2 GSH的检测
• 2.4.3 GSH的工作曲线及检出限
• 2.4.4 FT的检测
• 2.4.5 MT的检测
• 2.4.6 "三明治"杂交检测靶点DNA
• 2.5 小结
• 第三章 p53的电化学检测
• 3.1 引言
• 3.2 实验部分
• 3.2.1 实验试剂
• 3.2.2 实验仪器
• 3.3 实验过程
• 3.3.1 金电极预处理
• 3.3.2 DNA表面固定
• 3.3.3 p53的捕获以及Fc-Mi的衍生
• 3.3.4 电化学检测
• 3.3.5 Fc-Mi的合成路线设计
• 3.4 结果与讨论
• 3.4.1 检测原理
• 3.4.2 扫速对峰电流的影响
• 3.4.3 表面一致性双链DNA捕获p53的循环伏安响应
• 3.4.4 一致性双链DNA中碱基对数目错配对p53特异性作用的影响
• 3.4.5 二茂铁氧化峰电流与不同浓度p53的关系曲线
• 3.4.6 BSA干扰实验
• 3.5 小结
• 第四章 结论
• 参考文献
• 致谢
• 攻读硕士学位期间主要的研究成果目录